過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α rs8192678位點單核苷酸多態性與非酒精性脂肪性肝病發病風險的關系

張 青，劉守勝，孫寶凱，張 梅，辛永寧

青島大學附屬青島市市立醫院 a.感染性疾病科； b.感染性疾病與肝病研究室，山東 青島 266011

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是由肝臟內脂質堆積過多造成的一種病理結果，被認為是代謝綜合征在肝臟中的表現[1]。最新一項包含了237項研究的Meta分析[2]顯示亞洲NAFLD總患病率為29.62%。NAFLD已成為肝移植最常見的原因之一[3-4]。我國NAFLD發病率不斷增加，一項Meta分析[5]顯示其患病率已達29.2%。NAFLD是一種復雜的多因素疾病，涉及久坐、肥胖、不良的飲食習慣、肌肉減少、胰島素抵抗、遺傳易感性、腸道菌群等多種因素[6-9]，與糖尿病、心血管疾病以及腎臟疾病等多種疾病密切相關[10-12]。NAFLD的遺傳因素較復雜，現已經證明跨膜蛋白6超家族成員2、Patatin樣磷酯酶結構域蛋白3、溶血脂酰肌醇?；D移酶1與NAFLD的發生發展有密切關系，但其具體發病機制仍在不斷的研究和完善中[13]。

過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α(PPARGC1A)是一種蛋白質編碼基因，通過轉錄形成輔助激活因子來調節參與能量代謝的基因[14]。其功能涉及胰島素抵抗、脂質合成及轉運、氧化應激以及炎癥[15-18]。多項研究表明PPARGC1A單核苷酸多態性(SNP)在NAFLD發生發展過程中起著重要作用。2008年日本的一項研究[19]檢測了PPARGC1A rs2290602 SNP，最先發現PPARGC1A SNP是NAFLD的遺傳危險因素之一。2018年伊朗的一項研究[20]招募了288例超重或肥胖的女性，發現受試者總膽固醇(TC)和胰島素水平與 PPARGC1A rs2970847的T等位基因攜帶呈正相關。此外，在PPARGC1A rs11290186中，不攜帶A等位基因的受試者具有較高的三酰基甘油和胰島素水平。我國尚無PPARGC1A SNP與NAFLD關系的研究。本研究旨在探索PPARGC1A rs8192678 SNP與NAFLD的關聯，探討該位點SNP對NAFLD發生風險的影響，從而完善NAFLD的遺傳學研究。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年12月-2018年12月在青島市市立醫院就診的NAFLD患者(NAFLD組)和健康體檢者(對照組)。NAFLD由彩色超聲儀進行診斷，其診斷標準符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[21]。排除標準：有過量的飲酒史(男性飲酒折合乙醇量≥30 g/d，女性≥20 g/d)；病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝豆狀核變性等可以引起脂肪肝的肝臟疾??；近期服用引起肝損傷的藥物(如他莫昔芬、甲氨喋呤等)，以及其他能引起脂肪肝的全身性疾病(如炎癥性腸病、甲狀腺功能減退癥等)。

1.2 數據采集 在抽血前，獲取受試者性別、年齡、身高、體質量等基本信息，并計算BMI。NAFLD組和對照組均在禁食12 h后于正中靜脈抽取靜脈血4 ml，并分到2個EDTA抗凝管中進行后續的研究：一管血液樣本利用市立醫院檢驗科的自動生化分析儀進行生化指標的檢測，包括空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)、TC、ALT、AST、GGT、ALP、TBil；一管血液樣本存于-80 ℃冰箱內待提取DNA后進行基因型鑒定。

1.3 基因型鑒定 血液基因組DNA使用TIANGEN公司基因組純化試劑盒并按照說明書進行DNA提取，放置于-20 ℃冰箱進行保存。PPARGC1A rs8192678位點SNP首先采用PCR擴增出含有待檢SNP位點的目的片段，PCR上游引物：ACGTTGGATGTACTGAAATCACTGTCCCTC，下游引物：ACGTTGGATGAACAAGCACTTCGGTCATCC。首先94 ℃預變性5 min，之后進行45個循環的擴增反應，每次循環的程序為：94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。PPARGC1A rs8192678的基因型及等位基因分布運用質譜檢測(MALDI-TOF MS)的方法進行鑒定。

1.4 倫理學審查 本研究方案經由青島市市立醫院倫理委員會的審批[批號：2017臨審字第20號(快)]，所納入受試者均簽署了知情同意書。

1.5 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。評價樣本的群體性，采用χ2檢驗判斷樣本的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法則。正態分布的計量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態分布的計量資料用M(P25～P75)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗。計數資料兩組間比較采用χ2檢驗。采用二元logistic回歸分析NAFLD發生的危險因素。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 本研究納入NAFLD患者119例，其中女38例，男81例，平均年齡43歲；健康體檢者213例，其中女77例，男136例，平均年齡44歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P值均>0.05)。與對照組相比，NAFLD組BMI、FPG、TC、TG、LDL、ALT、GGT水平較高，HDL水平較低，差異均有統計學意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 兩組PPARGC1A rs8192678基因型及等位基因分布

基因測序分析后經χ2檢驗結果顯示，兩組PPARGC1A rs8192678的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P值分別為0.905、0.934)。兩組CC和CT基因型及C、T等位基因分布差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。二元logistic回歸分析顯示，PPARGC1A rs8192678位點CT基因型不是NAFLD發生的危險因素(比值比=0.951，95%可信區間：0.368～2.457，P=0.918)。

2.3 不同基因型受試者生化指標的比較 為進一步分析PPARGC1A rs8192678位點SNP與NAFLD相關指標的關系，分別在所有受試者、對照組及NAFLD組中比較不同基因型攜帶者各生化指標的差異。結果顯示，在所有受試者及對照組中，CT與CC基因型各生化指標差異均無統計學意義(P值均>0.05)(表3、4)；在NAFLD組中，CT基因型受試者GGT水平較高(P=0.020)(表5)。

表1 兩組基線資料及生化指標比較

表2 兩組受試者PPARGC1A rs8192678基因型及等位基因分布

表3 所有受試者中不同基因型攜帶者各生化指標比較

表4 對照組中不同基因型攜帶者各生化指標比較

表5 NAFLD組不同基因型攜帶者各生化指標比較

3 討論

NAFLD是一種環境與遺傳共同作用的代謝性疾病，以往研究[13]已經顯示多種基因在NAFLD的發生發展中起著非常重要的作用，參與脂質合成、分泌，載脂蛋白的合成與分解，胰島素抵抗，氧化應激等多種生理病理過程。本研究著眼于與能量代謝密切相關的PPARGC1A，研究該基因rs8192678 SNP對NAFLD的影響。

Piccinin等[22]發現PPARGC1A在NAFLD中表達降低，且PPARGC1A的表達與NAFLD嚴重程度呈負相關。但PPARGC1A rs8192678 SNP在NAFLD中的意義尚有爭議。PPARGC1A rs8192678位點的突變發生于外顯子區域，導致PPARGC1A編碼蛋白的第482位氨基酸由甘氨酸(Gly)變為絲氨酸(Ser)。有研究[23]顯示PPARGC1A rs8192678導致Gly482Ser，但不影響PPARGC1A蛋白的功能完整性。而Besse-Patin等[24]研究顯示PPARGC1A rs8192678位點改變會導致PPARG1A蛋白的半衰期縮短，PPARGC1A減少會促進小鼠NAFLD的發生。另一項在H4IIE細胞脂質堆積模型中的研究[25]顯示PPARGC1A Gly482Ser會減弱由PPARGC1A過表達引起的肝細胞脂質堆積減少，促進NAFLD發生。本研究對NAFLD患者和健康人群的PPARGC1A rs8192678 SNP進行檢測，發現在兩組中該基因位點的SNP無顯著性差異，可能是由于本研究受試者均為青島地區漢族人群，人種及環境單一，故需要進一步擴大樣本，進行多中心研究。

本研究結果顯示在NAFLD組中，CT基因型攜帶者相比于CC基因型攜帶者血清中GGT水平更高。GGT已被證明與NAFLD相關。Kozakova等[26]研究顯示血清GGT可能與脂肪肝和早期動脈粥樣硬化的發生有關。GGT水平還與代謝綜合征、肥胖相關。一項包含5404例上海社區人員的橫斷面研究[27]顯示，在中國成年人中，GGT與代謝綜合征存在顯著而獨立的相關性，且發生代謝綜合征的風險以GGT劑量依賴性方式增加；Botton等[28]對8～17歲兒童的研究顯示，超重及腹部脂肪增加與GGT水平升高有關。NAFLD被認為是代謝綜合征在肝臟中的表現，肥胖亦是其重要的發病因素之一，在本研究中，PPARGC1A rs8192678 SNP可能導致NAFLD患者血清GGT改變，提示PPARGC1A rs8192678可能通過GGT影響NAFLD的發病風險，值得更進一步的探索。

綜上所述，PPARGC1A rs8192678 SNP未增加NAFLD的發病風險，但在NAFLD患者中會提高血清GGT水平。本研究用超聲檢查來確定NAFLD，缺乏肝活檢，且僅對血液標本中的基因及生化指標進行了檢測，尚未對肝組織標本進行檢測。下一步的研究需要招募更多的受試者，增加對心血管相關指標的檢測并完善肝活組織檢查，探索相關機制，進一步研究PPARGC1A SNP對NAFLD的影響。