過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α rs8192678位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性與非酒精性脂肪性肝病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

張 青，劉守勝，孫寶凱，張 梅，辛永寧

青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 a.感染性疾病科； b.感染性疾病與肝病研究室，山東 青島 266011

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是由肝臟內(nèi)脂質(zhì)堆積過多造成的一種病理結(jié)果，被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)[1]。最新一項(xiàng)包含了237項(xiàng)研究的Meta分析[2]顯示亞洲NAFLD總患病率為29.62%。NAFLD已成為肝移植最常見的原因之一[3-4]。我國NAFLD發(fā)病率不斷增加，一項(xiàng)Meta分析[5]顯示其患病率已達(dá)29.2%。NAFLD是一種復(fù)雜的多因素疾病，涉及久坐、肥胖、不良的飲食習(xí)慣、肌肉減少、胰島素抵抗、遺傳易感性、腸道菌群等多種因素[6-9]，與糖尿病、心血管疾病以及腎臟疾病等多種疾病密切相關(guān)[10-12]。NAFLD的遺傳因素較復(fù)雜，現(xiàn)已經(jīng)證明跨膜蛋白6超家族成員2、Patatin樣磷酯酶結(jié)構(gòu)域蛋白3、溶血脂酰肌醇酰基轉(zhuǎn)移酶1與NAFLD的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但其具體發(fā)病機(jī)制仍在不斷的研究和完善中[13]。

過氧化物酶體增殖激活物受體γ輔激活因子1α(PPARGC1A)是一種蛋白質(zhì)編碼基因，通過轉(zhuǎn)錄形成輔助激活因子來調(diào)節(jié)參與能量代謝的基因[14]。其功能涉及胰島素抵抗、脂質(zhì)合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激以及炎癥[15-18]。多項(xiàng)研究表明PPARGC1A單核苷酸多態(tài)性(SNP)在NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。2008年日本的一項(xiàng)研究[19]檢測(cè)了PPARGC1A rs2290602 SNP，最先發(fā)現(xiàn)PPARGC1A SNP是NAFLD的遺傳危險(xiǎn)因素之一。2018年伊朗的一項(xiàng)研究[20]招募了288例超重或肥胖的女性，發(fā)現(xiàn)受試者總膽固醇(TC)和胰島素水平與 PPARGC1A rs2970847的T等位基因攜帶呈正相關(guān)。此外，在PPARGC1A rs11290186中，不攜帶A等位基因的受試者具有較高的三酰基甘油和胰島素水平。我國尚無PPARGC1A SNP與NAFLD關(guān)系的研究。本研究旨在探索PPARGC1A rs8192678 SNP與NAFLD的關(guān)聯(lián)，探討該位點(diǎn)SNP對(duì)NAFLD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的影響，從而完善NAFLD的遺傳學(xué)研究。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年12月-2018年12月在青島市市立醫(yī)院就診的NAFLD患者(NAFLD組)和健康體檢者(對(duì)照組)。NAFLD由彩色超聲儀進(jìn)行診斷，其診斷標(biāo)準(zhǔn)符合《非酒精性脂肪性肝病診療指南》[21]。排除標(biāo)準(zhǔn)：有過量的飲酒史(男性飲酒折合乙醇量≥30 g/d，女性≥20 g/d)；病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、肝豆?fàn)詈俗冃缘瓤梢砸鹬靖蔚母闻K疾病；近期服用引起肝損傷的藥物(如他莫昔芬、甲氨喋呤等)，以及其他能引起脂肪肝的全身性疾病(如炎癥性腸病、甲狀腺功能減退癥等)。

1.2 數(shù)據(jù)采集 在抽血前，獲取受試者性別、年齡、身高、體質(zhì)量等基本信息，并計(jì)算BMI。NAFLD組和對(duì)照組均在禁食12 h后于正中靜脈抽取靜脈血4 ml，并分到2個(gè)EDTA抗凝管中進(jìn)行后續(xù)的研究：一管血液樣本利用市立醫(yī)院檢驗(yàn)科的自動(dòng)生化分析儀進(jìn)行生化指標(biāo)的檢測(cè)，包括空腹血糖(FPG)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)、TC、ALT、AST、GGT、ALP、TBil；一管血液樣本存于-80 ℃冰箱內(nèi)待提取DNA后進(jìn)行基因型鑒定。

1.3 基因型鑒定 血液基因組DNA使用TIANGEN公司基因組純化試劑盒并按照說明書進(jìn)行DNA提取，放置于-20 ℃冰箱進(jìn)行保存。PPARGC1A rs8192678位點(diǎn)SNP首先采用PCR擴(kuò)增出含有待檢SNP位點(diǎn)的目的片段，PCR上游引物：ACGTTGGATGTACTGAAATCACTGTCCCTC，下游引物：ACGTTGGATGAACAAGCACTTCGGTCATCC。首先94 ℃預(yù)變性5 min，之后進(jìn)行45個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增反應(yīng)，每次循環(huán)的程序?yàn)椋?4 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min。PPARGC1A rs8192678的基因型及等位基因分布運(yùn)用質(zhì)譜檢測(cè)(MALDI-TOF MS)的方法進(jìn)行鑒定。

1.4 倫理學(xué)審查 本研究方案經(jīng)由青島市市立醫(yī)院倫理委員會(huì)的審批[批號(hào)：2017臨審字第20號(hào)(快)]，所納入受試者均簽署了知情同意書。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。評(píng)價(jià)樣本的群體性，采用χ2檢驗(yàn)判斷樣本的基因型分布是否符合Hardy-Weinberg平衡法則。正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料用M(P25～P75)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用二元logistic回歸分析NAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 本研究納入NAFLD患者119例，其中女38例，男81例，平均年齡43歲；健康體檢者213例，其中女77例，男136例，平均年齡44歲。兩組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。與對(duì)照組相比，NAFLD組BMI、FPG、TC、TG、LDL、ALT、GGT水平較高，HDL水平較低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表1)。

2.2 兩組PPARGC1A rs8192678基因型及等位基因分布

基因測(cè)序分析后經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組PPARGC1A rs8192678的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P值分別為0.905、0.934)。兩組CC和CT基因型及C、T等位基因分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。二元logistic回歸分析顯示，PPARGC1A rs8192678位點(diǎn)CT基因型不是NAFLD發(fā)生的危險(xiǎn)因素(比值比=0.951，95%可信區(qū)間：0.368～2.457，P=0.918)。

2.3 不同基因型受試者生化指標(biāo)的比較 為進(jìn)一步分析PPARGC1A rs8192678位點(diǎn)SNP與NAFLD相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系，分別在所有受試者、對(duì)照組及NAFLD組中比較不同基因型攜帶者各生化指標(biāo)的差異。結(jié)果顯示，在所有受試者及對(duì)照組中，CT與CC基因型各生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3、4)；在NAFLD組中，CT基因型受試者GGT水平較高(P=0.020)(表5)。

表1 兩組基線資料及生化指標(biāo)比較

表2 兩組受試者PPARGC1A rs8192678基因型及等位基因分布

表3 所有受試者中不同基因型攜帶者各生化指標(biāo)比較

表4 對(duì)照組中不同基因型攜帶者各生化指標(biāo)比較

表5 NAFLD組不同基因型攜帶者各生化指標(biāo)比較

3 討論

NAFLD是一種環(huán)境與遺傳共同作用的代謝性疾病，以往研究[13]已經(jīng)顯示多種基因在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用，參與脂質(zhì)合成、分泌，載脂蛋白的合成與分解，胰島素抵抗，氧化應(yīng)激等多種生理病理過程。本研究著眼于與能量代謝密切相關(guān)的PPARGC1A，研究該基因rs8192678 SNP對(duì)NAFLD的影響。

Piccinin等[22]發(fā)現(xiàn)PPARGC1A在NAFLD中表達(dá)降低，且PPARGC1A的表達(dá)與NAFLD嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。但PPARGC1A rs8192678 SNP在NAFLD中的意義尚有爭(zhēng)議。PPARGC1A rs8192678位點(diǎn)的突變發(fā)生于外顯子區(qū)域，導(dǎo)致PPARGC1A編碼蛋白的第482位氨基酸由甘氨酸(Gly)變?yōu)榻z氨酸(Ser)。有研究[23]顯示PPARGC1A rs8192678導(dǎo)致Gly482Ser，但不影響PPARGC1A蛋白的功能完整性。而Besse-Patin等[24]研究顯示PPARGC1A rs8192678位點(diǎn)改變會(huì)導(dǎo)致PPARG1A蛋白的半衰期縮短，PPARGC1A減少會(huì)促進(jìn)小鼠NAFLD的發(fā)生。另一項(xiàng)在H4IIE細(xì)胞脂質(zhì)堆積模型中的研究[25]顯示PPARGC1A Gly482Ser會(huì)減弱由PPARGC1A過表達(dá)引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積減少，促進(jìn)NAFLD發(fā)生。本研究對(duì)NAFLD患者和健康人群的PPARGC1A rs8192678 SNP進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在兩組中該基因位點(diǎn)的SNP無顯著性差異，可能是由于本研究受試者均為青島地區(qū)漢族人群，人種及環(huán)境單一，故需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，進(jìn)行多中心研究。

本研究結(jié)果顯示在NAFLD組中，CT基因型攜帶者相比于CC基因型攜帶者血清中GGT水平更高。GGT已被證明與NAFLD相關(guān)。Kozakova等[26]研究顯示血清GGT可能與脂肪肝和早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)。GGT水平還與代謝綜合征、肥胖相關(guān)。一項(xiàng)包含5404例上海社區(qū)人員的橫斷面研究[27]顯示，在中國成年人中，GGT與代謝綜合征存在顯著而獨(dú)立的相關(guān)性，且發(fā)生代謝綜合征的風(fēng)險(xiǎn)以GGT劑量依賴性方式增加；Botton等[28]對(duì)8～17歲兒童的研究顯示，超重及腹部脂肪增加與GGT水平升高有關(guān)。NAFLD被認(rèn)為是代謝綜合征在肝臟中的表現(xiàn)，肥胖亦是其重要的發(fā)病因素之一，在本研究中，PPARGC1A rs8192678 SNP可能導(dǎo)致NAFLD患者血清GGT改變，提示PPARGC1A rs8192678可能通過GGT影響NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，值得更進(jìn)一步的探索。

綜上所述，PPARGC1A rs8192678 SNP未增加NAFLD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，但在NAFLD患者中會(huì)提高血清GGT水平。本研究用超聲檢查來確定NAFLD，缺乏肝活檢，且僅對(duì)血液標(biāo)本中的基因及生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(cè)，尚未對(duì)肝組織標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。下一步的研究需要招募更多的受試者，增加對(duì)心血管相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)并完善肝活組織檢查，探索相關(guān)機(jī)制，進(jìn)一步研究PPARGC1A SNP對(duì)NAFLD的影響。