外泌體在胰腺癌轉移中的作用

李 瑞，張海蓉，張景麗，張宇艷，李若暢

昆明醫科大學第一附屬醫院 消化內科，昆明 650032

胰腺癌是發生于胰腺外分泌腺的惡性腫瘤，胰腺導管腺癌是胰腺癌的主要類型，占80%～90%，其致死率居世界惡性腫瘤中第七位[1]。胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，易出現轉移，然而現有的影像學檢查及血清學標志物難以發現其微小的轉移，80%以上的患者確診為胰腺癌時已出現明顯的遠處轉移，喪失了根治性手術的機會，5年的生存率僅有9%[2-4]。鑒于轉移是影響胰腺癌患者預后的主要原因，明確胰腺癌轉移的潛在機制，探索有效的治療方法是胰腺癌治療中亟待解決的問題。外泌體是由多種細胞分泌至細胞外的囊泡結構，研究發現外泌體與胰腺癌的侵襲轉移密切相關。本文就外泌體在胰腺癌的侵襲轉移方面進行綜述。

1 外泌體概述

幾乎所有的哺乳動物細胞無論在生理或病理過程中均會釋放細胞外囊泡，細胞外囊泡又分為胞外體和外泌體；胞外體是通過向細胞外萌芽并截取質膜表面而形成的囊泡，包括微囊泡、微粒子和直徑為50～1000 nm的大囊泡；外泌體是一種直徑大小為40～160 nm(平均100 nm)的細胞外囊泡。外泌體來源于質膜的連續內陷最終導致多囊小泡的形成，這些多囊小泡與細胞內的其他囊泡和細胞器相互作用，從而增加了外泌體成分的多樣性；成熟的細胞內多囊小泡與細胞膜融合后釋放到細胞外基質[5]。外泌體中主要包含蛋白質、脂質、核酸(非編碼RNA、mRNA和DNA)和代謝產物等生物大分子，并分布于血漿、尿液、唾液和乳汁等各種體液中[6]。目前可通過超速離心、超濾、尺寸排除色譜、聚合物沉淀法、免疫親和層析法和基于微流體的技術等方式對外泌體進行分離提純[7]。通常根據外泌體的大小和來源來選擇分離提純方法，但這些方法普遍存在提取效率低、價格昂貴、特異性較低等不足。

外泌體最早是1983年Pan和Johnstone[8]在綿羊網織紅細胞的體外實驗中發現。最初外泌體被認為是細胞的代謝廢物而未引起重視。近年來，隨著對外泌體的深入研究發現，外泌體在其表面表達特定的黏附分子、整合素和四跨膜蛋白，通過與跨膜受體和配體的相互作用來調節靶細胞對外泌體的吸收；然后以膜融合的方式將蛋白和核酸等物質轉運到受體細胞中以調控蛋白質表達和多種信號通路，從而在維持生理狀態和疾病進展等方面發揮生物學作用[9]。其生物學功能包括參與機體的免疫應答、抗原遞呈、腫瘤的侵襲轉移等[10]。

2 外泌體與胰腺癌的轉移

胰腺癌的轉移是腫瘤細胞侵襲性增強，通過血管浸潤離開原發部位，經循環系統擴散至全身各部位，然后在轉移部位定植的復雜多步驟過程。近年來研究發現外泌體在胰腺癌的轉移過程中發揮著重要作用；胰腺癌來源的外泌體通過作用于鄰近組織誘導上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)、促進血管生成，在遠隔器官處參與形成轉移前微環境以及抑制機體免疫等方式參與胰腺癌的侵襲及轉移。

2.1 外泌體與胰腺癌腫瘤微環境

腫瘤微環境是指腫瘤細胞所在的內外環境，由內皮細胞、免疫細胞和腫瘤相關成纖維細胞，以及分泌到組織間隙的細胞外基質和其他細胞因子組成的一個復雜異質性環境，與腫瘤的發生發展及轉移過程密切相關[11]。外泌體是腫瘤細胞與腫瘤微環境之間信號傳導的重要媒介。胰腺癌來源的外泌體通過作用于腫瘤微環境，誘導EMT，促進血管生成來介導胰腺癌的侵襲及轉移。

2.1.1 外泌體誘導EMT EMT是指在正常的生理或病理條件下上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，EMT不僅在胚胎發育和組織重建發揮了重要作用，而且是腫瘤浸潤和轉移的重要開端[12]。在EMT下，腫瘤細胞失去極性和細胞之間的緊密連接性降低，進入低增殖狀態，遷移侵襲、抗凋亡能力增強以及細胞外基質生成增多[13]。EMT的分子標志物是作為上皮標志物的E-鈣黏蛋白、細胞角蛋白缺失，作為間質標志物的波形蛋白和纖連蛋白表達增加[14]。腫瘤細胞具有上皮特征時有較強的增殖力，而間質特征易轉移。當腫瘤細胞經歷EMT后，轉移至遠隔器官又會向上皮形態逆轉(稱為間充質向上皮轉變)，然后腫瘤細胞將開始在轉移部位定植和增殖[15]。Li等[16]發現，具有高度侵襲性胰腺導管腺癌來源的外泌體lncRNA Sox2ot通過充當競爭性內源RNA誘導 EMT和干細胞樣特性，促進胰腺導管腺癌的侵襲和轉移；lncRNA Sox2ot過度表達，與胰腺導管腺癌患者的腫瘤淋巴結轉移分期和總生存率相關。Tang等[17]研究發現，胰腺癌患者與健康對照組之間血清純化外泌體蛋白質水平有顯著的差異，通過用胰腺癌患者的血清純化外泌體處理胰腺癌細胞(MiaPaCa-2和AsPC-1)，發現胰腺癌細胞中鈣黏蛋白表達顯著降低，波形蛋白表達顯著增加，證實了胰腺癌患者血清來源的外泌體能夠促進EMT。最近一項研究[18]發現，低氧情況下胰腺癌衍生的外泌體能夠激活PTEN/PI3Kγ信號通路，其次是通過依賴低氧誘導因子HIF1a或HIF2a的方式激活巨噬細胞轉化為M2表型，進而促進胰腺癌細胞EMT。綜上所述,外泌體通過誘導EMT增強胰腺癌細胞的侵襲性及轉移能力，是轉移形成的第一步，也是最重要的步驟；因此，靶向原發部位外泌體促進腫瘤細胞EMT或許是抗胰腺癌轉移治療的關鍵，但外泌體誘導EMT潛在的機制尚未完全闡明，仍需更多的研究來證實。

2.1.2 外泌體與血管生成和血管通透性 一方面血管的生成為腫瘤細胞的快速繁殖提供了重要的營養物質，并且是腫瘤細胞血行轉移的重要通道，是腫瘤生長和轉移的必要條件[19]。腫瘤細胞衍生的外泌體在促進血管生成中起著重要作用[20]。生理條件下的內皮細胞產生的外泌體能夠維持內皮細胞的穩態，但腫瘤細胞來源的外泌體會打破內皮細胞的穩態，病理性的促進血管生成[21]。另一方面增加血管的通透性也促進了腫瘤的浸潤及轉移。胰腺癌細胞產生的外泌體中的核酸物質、蛋白質等生物活性分子釋放到腫瘤微環境中，通過作用于血管內皮細胞促進血管生成和改變血管通透性來促進胰腺癌的侵襲和轉移。內皮細胞是一種位于各類器官微毛細血管床上的異質性細胞團，其中人微血管內皮細胞就是其中之一[22]。Shang等[23]研究發現，胰腺癌細胞衍生的外泌體中攜帶有miRNA-27a作用于血管內皮細胞，通過抑制靶基因BTG2的表達并上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)和血管內皮生長因子受體(VEGFR)的水平，從而促進胰腺癌中血管的生成。 Chiba等[24]研究中，胰腺癌細胞釋放的外泌體可以促進體外人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)的增殖；進一步研究發現，胰腺癌PK-45H細胞釋放的外泌體通過依賴HUVEC中的動力蛋白內吞作用激活內皮細胞中的AKT和ERK1/2激酶信號傳導通路，進而促進血管形成。另外有研究[25]發現，AsPC-1系胰腺癌細胞分泌的外泌體且富含花生四烯酸，能夠刺激巨噬細胞分泌PGE2和VEGF等，通過作用于血管內皮細胞從而促進血管生成。四跨膜蛋白Tspan8是在大鼠胰腺導管腺癌衍生的外泌體中發現的，表達Tspan8的外泌體與CD49d結合內皮細胞，誘導非VEGF依賴調控的幾種血管生成相關基因、趨化因子和受體的表達，促進內皮祖細胞增殖，遷移和成熟[26]。肌鐵蛋白是一種230 kD跨膜C2結構域蛋白，屬于Ferlin蛋白家族，在胰腺癌外泌體中過度表達，具有調控VEGF生成的作用，并參與腫瘤生長和腫瘤血管形成；經敲除肌鐵蛋白基因處理的胰腺導管腺癌產生的外泌體誘導HUVEC遷移和增殖能力明顯降低，從而抑制血管生成[27]。另外有研究[28]發現，外泌體中Circ-IARS在胰腺癌組織中高表達，Circ-IARS通過外泌體整合到臍靜脈內皮細胞，下調miRNA-122以及上調Ras同源基因家族成員A(RhoA) 和RhoA-GTP水平，促進細胞骨架肌動蛋白重構和內皮細胞收縮，并減少緊密連接蛋白ZO-1的表達，從而破壞了內皮細胞的屏障功能，導致血管的通透性增加，有利于腫瘤細胞穿透血管壁發生遠處轉移。綜上所述，胰腺癌來源的外泌體作用于血管對胰腺癌的生長和轉移具有重要的意義；目前關于外泌體對內皮細胞作用大多研究集中在促進血管生成作用上，在改變血管通透性方面的研究較少，還需更多的研究來進一步證實，從而為胰腺癌轉移的抗血管治療提供堅實的理論依據。

2.2 外泌體參與轉移前微環境的形成 轉移前微環境是在腫瘤細胞到達未來轉移部位之前出現的適合轉移瘤存活和生長的微環境，腫瘤來源的外泌體調節遠處轉移微環境中的間充質細胞，以促進腫瘤細胞的遠處定植和增殖[29]。外泌體可以介導鄰近或遠隔細胞間的信號傳導，其包含有調節轉移前微環境的關鍵因子。Hoshino等[30]研究發現，來源于胰腺癌的外泌體過度表達特異性整合素αvβ5具有一定的靶向性，可以選擇性地黏附于肝臟內細胞外基質豐富的區域，進而激活Src磷酸化和促炎S100基因的表達，觸發炎癥反應和免疫抑制性細胞的招募，以促進轉移前微環境形成。在小鼠胰腺癌模型中,胰腺導管腺癌衍生的外泌體能夠誘導肝臟轉移前的微環境形成，外泌體中巨噬細胞遷移抑制因子能夠誘導肝臟Kupffer細胞釋放轉化生長因子，進而促進肝星狀細胞產生纖連蛋白，纖連蛋白沉積有助于骨髓來源的巨噬細胞和中性粒細胞在肝臟中的募集，從而完成了轉移前微環境的形成[29]。Rana等[31]研究發現，轉移性大鼠胰腺癌BSp73ASML的外泌體中miRNA能下調鈣黏蛋白17，促進蛋白酶、黏附分子和其他相關蛋白質的表達，從而促進轉移前微環境的形成，為腫瘤細胞轉移至肺部或淋巴結做準備。綜上所述，外泌體在胰腺癌形成轉移前微環境中起重要作用；因此，可以針對外泌體在轉移微環境形成的機制來尋找治療靶點。

2.3 外泌體與免疫抑制微環境 當胰腺癌細胞轉移至遠隔器官后, 需要逃避機體的免疫監視,并抑制機體對轉移瘤的免疫清除，才能存活下來。胰腺癌來源的外泌體傳遞免疫抑制信號分子能夠促進免疫抑制性細胞的分化和募集，并靶向調節免疫細胞的發育、成熟、活化以及抗腫瘤能力，從而建立免疫抑制微環境來維持腫瘤細胞的增殖。骨髓來源的抑制性細胞(myeloid-derived suppressor cells，MDSC)是一類具有抑制自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞的免疫作用以及促進調節性T淋巴細胞形成等功能的未成熟骨髓細胞[32]。胰腺導管腺癌衍生的外泌體中蛋白質和miRNA-1260a及miRNA-494-3p通過依賴smad4的方式來影響骨髓細胞中的鈣流量和糖酵解，從而誘導MDSC的形成[33]。Chalmin等[34]在原位胰腺癌小鼠模型注射胰腺導管腺癌Panc02-H7細胞來源的外泌體，發現肝臟MDSC浸潤增加，同時外泌體也觸發了MDSC中信號傳導和活化轉錄因子3的激活，隨之激活了MDSC的免疫抑制功能，這有助于建立免疫抑制微環境。胰腺癌外泌體中的miRNA-203能夠下調樹突細胞(DC)中的Toll樣受體4和細胞因子TNFα和IL-12等，從而削弱DC的免疫功能，而敲除miRNA-203的外泌體可逆轉這一現象[35]。另一項研究[36]發現，胰腺導管腺癌衍生的外泌體通過miRNA-212-3p抑制調節因子X相關蛋白表達，使DC無法激活CD4+T淋巴細胞，以降低MHC Ⅱ表達并誘導DC的免疫耐受，這有助于在胰腺導管腺癌微環境中產生免疫耐受。Zech等[37]的研究發現，大鼠導管腺癌衍生的外泌體作用于DC和巨噬細胞會干擾IL-2活化淋巴細胞，并通過抑制AKT/PI3K信號通路誘導淋巴細胞凋亡。此外，低氧誘導的外泌體miRNA-301a-3p激活PTEN/PI3Kγ信號通路，使巨噬細胞極化到原瘤M2表型，并抑制T淋巴細胞分泌細胞因子；極化的M2巨噬細胞還會促進與胰腺癌免疫抑制巨噬細胞表型相關基因的轉錄，從而促進胰腺癌的侵襲及轉移[18]。Que等[38]通過裂解和超濾的方式去除外泌體中miRNA，同時保留補體多肽等蛋白質成分，缺失miRNA的外泌體可促進DC的增殖及TNFα的產生和穿孔素的分泌，從而增強對體外胰腺癌細胞的殺傷作用，表明外泌體有可能成為胰腺癌的免疫治療的潛在靶點。綜上所述，外泌體通過介導免疫調節，參與免疫抑制微環境的形成，促進胰腺癌的侵襲和轉移。因此，阻斷外泌體介導的免疫抑制性腫瘤微環境的形成對胰腺癌的治療有重要意義。

3 總結

外泌體介導細胞間信號傳導，與胰腺癌的轉移密切相關；首先外泌體在胰腺癌腫瘤微環境中誘導EMT使腫瘤細胞獲得高侵襲性和促進血管生成有助于腫瘤細胞經血管進入體循環，外泌體還能定位腫瘤細胞將要轉移的器官，然后參與形成利于轉移瘤生長的轉移前微環境，并通過生物活性分子抑制機體免疫進而影響胰腺癌轉移。外泌體參與胰腺癌轉移的過程為理解胰腺癌的轉移背景提供了新的見解；因此，阻斷或抑制外泌體的生成有望成為胰腺癌治療的潛在靶點。目前關于外泌體在胰腺癌轉移調控中的作用研究正處于初始階段，大部分研究主要集中在動物模型上及體外實驗，對其潛在機制還需更多的臨床研究來闡明。此外，由于外泌體體積較小，種類繁多，對其分析非常困難，目前尚無經濟、簡便、標準的外泌體的分離提取技術，限制了外泌體的研究，外泌體應用于臨床實踐還有很長的路要走。但隨著外泌體分離提取技術和基因測序的快速發展及人們對外泌體的深入研究，未來將會發現針對胰腺轉移的有效治療措施，從而改善胰腺癌患者的預后。