HBXIP抑制補體介導的細胞毒活性促進肝癌免疫逃逸的機制研究①

安 萍 沈學斌 卞 麗 尚 寧 郭佳晶 石曉琳 賈景飛

(沈陽市第六人民醫院肝病免疫科,沈陽 110006)

肝癌是臨床常見消化道惡性腫瘤，發病率和死亡率高居惡性腫瘤第六位和第二位，惡性程度高、療效差、易轉移和復發，因此深入研究肝癌發生發展及其免疫逃逸機制對其臨床治療具有重要作用[1]。乙肝病毒X蛋白結合蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)是哺乳動物細胞的組成型蛋白，可與乙肝病毒X(HBX)的C末端特異性結合[2]。研究顯示，HBXIP與乳腺癌、肝癌及卵巢癌等腫瘤的發生發展關系密切[3]。Melegari等[4]證明HBXIP可通過下調HBX活性調節乙肝病毒的復制周期，參與乙肝病毒相關肝癌的發生發展。目前HBXIP研究主要集中于腫瘤細胞凋亡及有絲分裂等過程，腫瘤轉移和免疫逃逸等方面的研究相對較少。本研究探究HBXIP與肝癌細胞免疫逃逸的關系及其分子機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系反載體 HEK293T、HepG2細胞株由我院實驗室保存，含10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM培養基于37℃、5%CO2培養。pLent-GFP-NC-shRNA和pGLVH1-GFP-HBXIP-1-shRNA慢病毒載體由山東維真生物科技有限公司構建。

1.1.2試劑與儀器 LipofectamineTM2000轉染試劑、嘌呤霉素購自美國Thermo Fisher Scientific；RNAprep pure總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeScript RT reagent Kit逆轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq熒光定量試劑均購自日本TaKaRa公司；HBXIP、CD46、CD55、CD59、NF-κB p65兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；臺盼藍染液購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1慢病毒穩定細胞系構建 HEK293T細胞培養至對數生長期，胰酶消化，接種于6孔板。分別將NC-shRNA和HBXIP-1-shRNA慢病毒載體與包裝質粒psPAX2、pMD2.G共轉染至HEK293T細胞，6 h后換液，48 h后收集上清，0.45 μm過濾器過濾，分別加入對數生長期的HepG2細胞中。48 h后換液，加入終濃度為1 μg/ml的嘌呤霉素篩選，至細胞不再死亡且顯微鏡表達綠色熒光，撤去嘌呤霉素擴大培養。

1.2.2RT-PCR檢測HBXIP mRNA表達 收集NC-shRNA和HBXIP-shRNA細胞各1×105個，提取總RNA，逆轉錄為cDNA。引物序列為：HBXIPF：5′-GACCTTGGAGCAGCACTTG-3′，R：5′-GATTCTAGACACACCACAGG-3′；Tubulin為內參，F：5′-GTTCCTCGTGCCATCCTGG-3′，R：5′-CAGGCAGTCACAG-CTCTCTG-3′。RT-PCT反應體系為：95℃ 5 min，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環。2-ΔΔCt法計算HBXIP mRNA水平。

1.2.3Western blot檢測CD46、CD55、CD69蛋白表達 收集NC-shRNA和HBXIP-shRNA細胞各5×106個，加入500 μl細胞裂解液，冰上裂解20 min。12 000 g 離心15 min，取上清，加入1×SDS Loading buffer，金屬浴煮沸10 min。SDS-PAGE電泳、轉膜、5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入封閉液稀釋的一抗(CD46兔單克隆抗體1∶5 000，CD55兔單克隆抗體1∶10 000，CD59兔單克隆抗體2 μg/ml)，4℃孵育過夜。PBST洗滌3次，加入封閉液稀釋的HRP羊抗兔/鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育1 h。PBST洗滌3次，涂抹ECL發光液，暗室顯影。

1.2.4補體介導的細胞毒活性檢測 調整NC-shRNA和HBXIP-shRNA細胞密度至1×105個/ml，接種至24孔板，每組細胞分為人正常血清組和人滅活血清組。12 h后PBS洗滌3次，分別加入50 μl人正常血清和人滅活血清，37℃孵育1 h。吸除血清稀釋液，PBS洗滌3次。200 μl/孔加入4%臺盼藍染液，37℃孵育30 min。棄染液，PBS洗3次，300 ml/孔加入0.1% SDS裂解液，室溫孵育30 min。取裂解上清，酶標儀檢測590 nm處吸光度值。重復3次。

1.2.5免疫熒光檢測NF-κB的活性變化 胰酶消化NC-shRNA細胞和HBXIP-shRNA細胞，新鮮培養基重懸，爬片，培養12 h使細胞貼壁。取出爬片，PBS洗3次，預冷4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗3次，0.5%Triton穿孔15 min。PBS洗3次，1%BSA封閉1 h。加入1%BSA稀釋的一抗，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入1%BSA稀釋的二抗，37℃孵育1 h。PBS洗3次，滴加DAPI，避光孵育5 min。PBS洗3次，封片，鏡檢。

1.2.6Rescue實驗檢測恢復NK-κB表達對CD46、CD55和CD59的影響 分子克隆構建pcDNA3.1-NF-κB質粒。取生長狀態良好的NC-shRNA細胞和HBXIP-shRNA細胞，接種于6孔板。HBXIP-shRNA細胞分為2組，分別轉染pcDNA3.1空載和pcDNA3.1-NF-κB過表達質粒，轉染6 h后換液，36 h 后收集細胞，Western blot檢測各組細胞CD46、CD55和CD59蛋白表達情況。

2 結果

2.1HBXIP表達水平比較 RT-PCR和Western blot結果顯示，與NC-shRNA細胞相比，HBXIP-shRNA細胞的HBXIP基因表達水平與蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，可用于后續實驗，見圖1。

圖1 HBXIP mRNA表達水平比較Fig.1 Comparison of HBXIP mRNA expressionNote:Compared with NC-shRNA，*.P<0.05.

2.2HepG2細胞對補體介導的細胞毒作用的敏感性 加入滅活血清的NC-shRNA細胞和HBXIP-shRNA細胞的吸光度值差異無統計學意義(P>0.05)；HBXIP-shRNA細胞補體介導的細胞毒作用顯著升高(P<0.05)，提示HBXIP在HepG2細胞補體介導的細胞毒作用中發揮重要調控作用，見圖2。

圖2 HBXIP對補體介導的細胞毒作用的影響Fig.2 Effect of HBXIP on complement-mediated cytotoxicityNote:Compared with NC-shRNA，*.P<0.05.

2.3HBXIP對CD46、CD55、CD59表達的影響 與NC-shRNA細胞相比， HBXIP-shRNA細胞中CD46、CD55、CD59蛋白相對表達水平均顯著下降(P<0.05)，見圖3。

圖3 HBXIP對CD46、CD55、CD59表達的影響Fig.3 Effect of HBXIP on expression of CD46,CD55 and CD59Note:Compared with NC-shRNA，*.P<0.05.

2.4HBXIP對NF-κB活性的影響 與NC-shRNA細胞相比，HBXIP-shRNA細胞NF-κB蛋白的入核數量明顯降低(P<0.05)，見圖4。

圖4 HBXIP對NF-κB活性的影響Fig.4 Effect of HBXIP on NF-κB activity

2.5過表達NF-κB對CD46、CD55、CD59表達的影響 與HBXIP-shRNA細胞相比，HBXIP-shRNA+NF-κB細胞中CD46、CD55、CD59蛋白表達均明顯提高(P<0.05)，見圖5。

圖5 NF-κB過表達對CD46、CD55、CD59表達的影響Fig.5 Effect of NF-κB overexpression on CD46,CD55 and CD59Note:Compared with NC-shRNA，*.P<0.05；compared with HBXIP-shRNA，#.P<0.05.

3 討論

HBXIP最早于1998年通過酵母雙雜交技術從肝癌細胞HepG2中獲得，普遍表達于高等動物各組織，廣泛參與基因轉錄、信號轉導、細胞增殖和凋亡等過程，與癌癥發生發展密切相關[5]。HBV引起的乙肝患者中，HBXIP可與HBx結合抑制其對HBV啟動子的反式激活，改變HBV復制周期[4]。HBXIP還可與Suivivin結合，通過抑制pro-caspase-9活化抑制線粒體/細胞色素C途徑介導的細胞凋亡[6]；HBXIP可通過上調cyclin D1、Bcl-2、PCNA等蛋白表達，促進乳腺癌細胞由G1期向S期轉變，加速乳腺癌進展[7]。研究證明HBXIP在肝癌患者中高表達，促進肝癌細胞增殖與遷移，但其在肝癌細胞免疫逃逸中的作用機制尚不明確[8，9]。Cui等[10]證實HBXIP在乳腺癌中可通過ERK1/2/NF-κB信號通路上調CD46、CD55和CD59表達保護乳腺癌細胞免受人體免疫系統的識別和攻擊。本研究通過下調肝癌細胞HBXIP表達，探究HBXIP對補體介導的細胞毒活性的影響及其在肝癌細胞免疫逃逸中的作用機制。

腫瘤細胞可通過與微環境相互作用，或修飾、改變自身的表面抗原來逃避宿主的免疫識別與殺傷。機體對腫瘤的免疫作用包括細胞免疫和體液免疫，抗體依賴介導的細胞毒作用和補體依賴的細胞毒作用是體液免疫重要的抗腫瘤機制[11]。膜結合補體調節蛋白通過與不同補體相互作用，維持補體激活和抑制的平衡狀態，在調節補體攻擊腫瘤細胞的過程中發揮重要作用[12]。目前研究較多的膜結合補體調節蛋白包括CD46(膜輔助蛋白)、CD55(衰變加速因子)及CD59(保護素)，是補體經典和旁路激活的重要抑制因子[13]。近年研究顯示，CD46、CD55和CD59在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、腸癌等多種惡性腫瘤中高表達，并通過影響補體激活保護腫瘤細胞免受補體系統攻擊，是引發腫瘤細胞免疫逃逸的重要途徑[14，15]。本研究顯示，與對照組肝癌細胞相比，HBXIP敲低的肝癌細胞中CD46、CD55和CD59蛋白表達顯著下降，肝癌細胞對補體介導的細胞毒作用的敏感性明顯提高，提示HBXIP表達降低可顯著影響CD46、CD55和CD59等膜結合補體調節蛋白的分泌，抑制肝癌細胞免疫逃逸。

NF-κB是細胞內重要的轉錄因子，通過調控其下游基因的轉錄和表達參與細胞增殖、凋亡、炎癥、免疫及腫瘤發生等多種生理病理過程。NF-κB通常以同源或異源二聚體形式存在，在靜息狀態下，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合以無活性狀態存在于細胞質；當細胞受到外界刺激時，IκB從NF-κB復合體上解離降解，暴露NF-κB的核定位序列，入核介導其下游靶基因的轉錄調控[16]。本研究顯示，抑制HBXIP表達后，NF-κB活性顯著下降，與既往研究結論一致[17]。為進一步探究HBXIP對CD46、CD55和CD59蛋白表達的調控是否與NF-κB信號通路相關，本研究在HBXIP-shRNA細胞中過表達NF-κB，結果顯示，當在HBXIP敲低的細胞中恢復NF-κB表達時，CD46、CD55和CD59蛋白表達也隨之上升，提示NF-κB信號通路的激活受HBXIP調控，而NF-κB的活化又可直接影響CD46、CD55和CD59表達及肝癌細胞免疫逃逸。此外，研究顯示肝癌細胞還可釋放TGF-β、VEGF、IL-10等多種細胞因子提高T細胞凋亡、影響T細胞亞群的比例或其免疫活性，導致肝癌細胞的免疫耐受[18]。而以上細胞因子的表達均受NF-κB嚴格調控。Hu等[19]研究顯示HBXIP可通過激活NF-κB通路上調IL-8表達，促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。因此，HBXIP可能通過調控NF-κB的活性影響多條信號途徑，參與肝癌細胞的免疫逃逸。

綜上所述，下調HBXIP表達可顯著抑制肝癌細胞免疫逃逸，有望為肝癌的臨床治療開辟新思路。