大黃酚介導AMPK依賴性信號通路抑制結腸癌SW480細胞的增殖、侵襲和裸鼠體內腫瘤形成①

代繼源 劉文杰 王春輝

(山東省昌邑市人民醫院胃腸肛腸外科，昌邑 261300)

結腸癌是全球范圍內最常見的惡性腫瘤之一，位居胃腸道腫瘤發病率前三，且不斷上升[1，2]。結腸癌治療以降低復發率和提高存活率為主要目標，包括手術治療、化學治療和放射治療等綜合治療手段。目前，多種植物提取物被用于結腸癌防治，在亞洲，大黃廣泛用于發熱、腹瀉治療，具有解毒功效，主要活性成分是蒽醌類化合物，其中大黃酚對許多腫瘤細胞活性均有抑制作用，可通過線粒體鈣超載誘導卵巢癌細胞死亡、并抑制其侵襲性；通過調節ROS、AKT和ERK1/2信號通路誘導絨毛膜癌細胞凋亡，抑制大腸癌細胞缺氧誘導的上皮間充質轉化等[3-6]。然而，大黃酚對人結腸癌SW480細胞的作用尚未闡明。本實驗以人結腸癌SW480細胞株為研究對象，研究大黃酚對其體外增殖、侵襲和體內腫瘤形成的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1材料 人結腸癌細胞株SW480購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；SPF級裸鼠購自北京維通利華實驗動物公司，本研究動物實驗在我院動物倫理委員會批準下進行。RPMI1640培養液、FBS、0.25%胰蛋白酶、DMSO購自美國Gibco公司；注射用硫酸鏈霉素購自華北制藥股份有限公司；注射用青霉素鈉購自上海新先鋒藥業有限公司；RIPA裂解液、大黃酚(純度≥98%)購自美國Sigma公司，大黃酚用DMSO和無血清培養基溶解配制；BCA試劑盒購自碧云天生物科技公司；單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Santa Cruze公司；免疫組化檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Transwell小室購自北京優尼康生物技術有限公司；Matrix基質膠購自美國BD公司。

1.1.2儀器 恒溫培養箱購自美國ThermoForma公司；PCR儀、電泳儀和半干轉膜儀購自美國BIO-RAD公司；Gel View 6000化學發光凝膠成像系統購自廣州云星儀器有限公司；低溫離心機購自美國IEC公司；超凈工作臺購自蘇州中亞凈化設備有限公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將結腸癌細胞株SW480細胞懸浮于含10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI1640培養基中，于37℃、5%CO2條件下培養。鏡下觀察細胞生長狀態，當細胞融合率達到80%以上時消化傳代。用配好的培養基制成細胞懸液。

1.2.25-溴脫氧尿嘧啶核苷(Brdu)染色檢測細胞增殖情況 接種第3代SW480細胞于96孔板，每孔加入2×104個/ml細胞懸液200 μl，待細胞貼壁后，用含0.4%FBS的培養液同步化孵育細胞72 h。將細胞分為4組，分別加入不同濃度大黃酚(終濃度分別為0、25、50、100 μmol/L)處理48 h，加入終濃度為0.03 μg/ml的Brdu，繼續孵育40 min。棄培養液，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定細胞30 min。鏡下隨機選取3個視野觀察并拍照。實驗至少重復3次，每組6個復孔。Brdu陽性細胞呈綠色熒光，Brdu陽性細胞標記率=綠色熒光細胞數/細胞總數×100%。

1.2.3劃痕實驗檢測細胞遷移能力 以1×105個/ml密度接種SW480細胞，待細胞貼壁后，用10 μl槍頭垂直劃痕，PBS洗去脫落細胞。將細胞隨機分為4組，加入10 μg/ml絲裂霉素C并分別給予不同濃度大黃酚(終濃度分別為0、25、50、100 μmol/L)處理后繼續培養24 h。于光學顯微鏡下隨機選取5個視野觀察并拍照，劃痕閉合率 =(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 提前用Matrigel基質膠包被Transwell小室上層，以1×105個/ml密度接種SW480細胞，培養液不加FBS，Transwell小室下層加入含FBS的細胞培養液。培養24 h后，用無菌棉簽拭去Matrigel基質膠和小室上層細胞，PBS洗滌2次后，4%多聚甲醛固定小室，結晶紫染色遷移至小室下層的SW480細胞，流水沖洗后自然晾干。鏡下隨機選取3個視野計數染色細胞。實驗重復3次，每組6個復孔。

1.2.5免疫熒光法檢測大黃酚對波形蛋白(vimentin)表達的影響 細胞分組方法1.2.3，各組用PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定15 min，輕輕去除固定液，PBS漂洗3次，加入1 ml DAPI染液，室溫染色5 min，輕輕吸去染液，PBS漂洗3次，鏡下觀察。

1.2.6免疫組織化學法檢測移植瘤裸鼠腫瘤組織Ki67和VEGF表達情況 SPF級裸鼠無菌環境飼養，溫度為26～28℃，濕度為50%～60%，光照10 h，自由采食和飲水，適應性飼養7 d后進行實驗。取結腸癌SW480細胞并調整密度至2×107個/ml，于裸鼠頸部相同部位皮下注射上述細胞懸液0.2 ml以建立移植瘤裸鼠模型。次日，將模型動物隨機分為4組，每組10只，分別1次/d腹腔注射PBS和12.5、25、50 mg/kg 大黃酚，每天給藥1次，連續給藥30 d。實驗完成時摘取腫瘤并稱重，制成約4 μm的石蠟切片，嚴格按照試劑盒說明書進行免疫組織化學染色，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸酒精分色，光學顯微鏡下觀察Ki67和VEGF表達情況。

1.2.7Western blot檢測增殖、上皮間充質轉化和信號通路相關蛋白的表達 用含蛋白抑制劑的RIPA蛋白裂解液于冰上裂解，提取各組細胞或腫瘤組織總蛋白，12 000 g 4℃離心10 min，取上清用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白變性后，取等量蛋白凝膠電泳分離蛋白，轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白質2 h，加入一抗，4℃孵育過夜。棄一抗，緩沖液清洗后加入對應二抗，室溫孵育1 h。滴加電化學發光(ECL)顯色液于暗室曝光顯影，以GAPDH為內參。

2 結果

2.1大黃酚對體外培養SW480細胞增殖能力的影響 Brdu染色結果顯示，隨著大黃酚濃度增加，綠色熒光逐漸減少，Brdu陽性細胞數量呈劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.01)，見圖1、2。免疫組織化學法和Western blot檢測SW480細胞的增殖相關蛋白表達結果顯示，體外培養的結腸癌SW480細胞高表達Ki67和PCNA蛋白；經不同濃度的大黃酚處理后，兩者表達水平均呈劑量依賴性降低(P<0.05或P<0.01)，見圖2、3。結果提示，大黃酚可呈劑量依賴性減弱SW480細胞的增殖能力。

圖1 Brdu染色檢測SW480細胞增殖能力Fig.1 Proliferation ability of SW480 cells were detected by Brdu staining

圖2 大黃酚對SW480細胞增殖及增殖相關蛋白表達的影響Fig.2 Effect of chrysophanol on proliferation and expression of proliferation-related protein in SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖3 Western blot檢測SW480細胞增殖相關蛋白表達Fig.3 Expresions of proliferation-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

2.2大黃酚對體外培養SW480細胞遷移及侵襲能力的影響 劃痕實驗結果顯示，與未經大黃酚處理組相比，各給藥組細胞劃痕閉合率均呈劑量依賴性減少(P<0.05或P<0.01)，見圖4、5。Transwell實驗結果顯示，與未經大黃酚處理組相比，各給藥組侵襲細胞數量明顯減少，且大黃酚濃度越大，侵襲細胞數越少(P<0.05或P<0.01)，見圖5、6。結果提示，大黃酚能呈劑量依賴性地降低SW480細胞遷移及侵襲能力。

圖4 細胞劃痕實驗檢測SW480細胞遷移情況Fig.4 Migration of SW480 cells was detected by scratch assay

圖5 大黃酚對SW480細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.5 Effects of chrysophanol on migration and invasion of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖6 Transwell實驗檢測SW480細胞侵襲能力Fig.6 Invasive ability of SW480 cells were detected by Transwell

2.3大黃酚對體外培養SW480細胞腫瘤上皮間充質轉化(EMT)的影響 Western blot檢測結果顯示，與未經大黃酚處理組相比，各給藥組遷移相關蛋白VEGF、間充質標記蛋白N-cadherin的表達水平顯著降低，且與大黃酚給藥濃度呈負相關；而上皮標記蛋白E-cadherin的表達水平呈大黃酚劑量依賴性上調(P<0.05或P<0.01)，見圖7、8。免疫熒光法結果顯示，與未經大黃酚處理組相比，各給藥組SW480細胞內波形蛋白熒光量隨大黃酚濃度增加而顯著降低，即波形蛋白表達量呈大黃酚劑量依賴性降低(P<0.05或P<0.01)，見圖8、9。因此，大黃酚能呈劑量依賴性地抑制體外培養SW480細胞轉移能力。

圖7 Western blto蛋白印跡法檢測SW480細胞EMT相關蛋白表達Fig.7 Expresions of EMT-related proteins in SW480 cells were detected by Western blot

圖8 大黃酚對SW480細胞上皮間充質轉化的影響Fig.8 Effects of chrysophanol on EMT of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

圖9 免疫熒光法檢測Vimentin蛋白表達Fig.9 Expresion of Vimentin protein was detected by immunofluorescence

2.4大黃酚對體外培養SW480細胞信號通路的影響 Western blot結果顯示，與未經大黃酚處理組相比，大黃酚給藥組AMPKα1磷酸化水平均明顯增強，且各組間差異具有統計學意義，與大黃酚濃度呈正相關(P<0.05或P<0.01)，見圖10；各給藥組P-mTOR/mTOR和cyclin D1的表達水平明顯下降，與大黃酚濃度呈負相關(P<0.05或P<0.01)，見圖10。提示大黃酚可促進SW480細胞AMPKα1磷酸化激活，而對mTOR和cyclin D1的表達則表現出明顯抑制作用，且均呈劑量依賴性。

圖10 大黃酚對SW480細胞信號通路的影響Fig.10 Effect of chrysophanol on signaling pathway of SW480 cellsNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol (25 μmol/L) group,#.P<0.05;compared with chrysophanol (50 μmol/L) group,△.P<0.05.

2.5大黃酚對結腸癌移植瘤小鼠腫瘤形成的影響 移植瘤小鼠存活率顯示，與對照組相比，各給藥組移植瘤小鼠存活率遞減，見圖11。各組移植瘤小鼠腫瘤重量顯示，與對照組(0.45±0.09)g相比，各給藥組移植瘤小鼠的腫瘤重量分別為(0.32±0.06)g、(0.24±0.07)g和(0.15±0.04)g，即隨大黃酚劑量增加，腫瘤重量減小(P<0.05或P<0.01)。Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，隨大黃酚給藥濃度增加，各給藥組小鼠腫瘤組織中p-AMPK/AMPK表達水平顯著上調，P-mTOR/mTOR和cyclin D1表達水平顯著下調，且均與大黃酚劑量相關(P<0.05或P<0.01)，見圖12、13。免疫組織化學結果顯示，大黃酚給藥濃度越大，腫瘤組織Ki67和VEGF陽性顆粒越少(P<0.05或P<0.01)，見圖13、14，即大黃酚可抑制Ki67、VEGF表達。結果提示，大黃酚能劑量依賴性地促進AMPKα1激活、抑制mTOR和cyclin D1蛋白表達，從而抑制腫瘤在移植瘤小鼠體內的形成，降低移植瘤小鼠腫瘤組織重量，提高小鼠存活率。

圖11 移植瘤小鼠存活率Fig.11 Survival rate of transplanted tumors in mice

圖12 Western blot檢測腫瘤組織中通路蛋白表達Fig.12 Expresions of pathway proteins in tumor tissue were detected by Western blot

圖13 大黃酚對結腸癌移植瘤模型小鼠腫瘤形成的影響Fig.13 Effect of chrysophanol on tumorigenesis of colon cancer model miceNote:Compared with control group,**.P<0.01;compared with chrysophanol group (25 mg/kg),#.P<0.05；compared with chrysophanol (50 mg/kg) group,△.P<0.05.

圖14 免疫組化檢測腫瘤組織中Ki67和VEGF表達情況Fig.14 Expresion of Ki67 and VEGF in tumor tissue were detected by immunohistochemical

3 討論

結腸癌是三大惡性腫瘤之一，具有較高的發病率和病死率，其發生與多種因素相關，包括細胞增殖、轉移、凋亡、腫瘤微環境和自身免疫系統。中醫藥已廣泛用于癌癥治療，作用于多種信號傳導途徑且不良反應較少[7]。大黃酚是中藥大黃的有效成分之一，是蒽醌類化合物，具有多種生物學活性，如對絨毛膜癌、前列腺癌的抗腫瘤活性[4,8,9]。目前，關于大黃酚對人結腸癌SW480細胞增殖的作用尚未見報道。因此，本實驗選取人結腸癌SW480細胞，探討大黃酚對SW480細胞的影響及機制。

抑制腫瘤細胞增殖是抗癌藥發揮作用的重要途徑。研究表明，同為大黃提取物的大黃酸，對表皮生長因子受體(EGFR)過表達的SNU-C5人結腸癌細胞具有抗癌活性，通過抑制EGFR/mTOR信號通路阻斷結腸癌細胞增殖發揮作用[10]。而大黃酚能抑制體外培養的乳腺癌MCF-7細胞和MDA-MB-231細胞增殖，并誘導細胞凋亡，從而發揮抗乳腺癌作用[8]。本研究發現在體外培養的人結腸癌SW480細胞中，大黃酚可劑量依賴性地抑制增殖相關蛋白Ki67和KCNA表達，降低Brdu陽性細胞數，從而抑制腫瘤細胞增殖。

另外，抑制腫瘤細胞侵襲和轉移是抗癌藥的又一重要途徑。研究表明，抑制腫瘤細胞中VEGF表達可有效抑制其增殖和轉移，且VEGF家族及其受體可能是惡性腫瘤新的預后標志物[11-13]。決明子蒽酮-C-糖苷、決明子苷在結腸癌荷瘤小鼠體內的抗腫瘤和抗轉移作用主要與抑制VEGF和MMP-9表達及VEGFR-2磷酸化等有關[14]。EMT是上皮細胞失去極性、獲得間充質特性而增加轉移和侵襲的過程，是腫瘤發生轉移和侵襲的重要過程[15,16]。當發生EMT時，上皮標記蛋白E-cadherin明顯下調，同時間充質標記波形蛋白表達上升[17]。本研究發現，大黃酚能抑制細胞侵襲，下調VEGF、N-cadherin及波形蛋白，上調E-cadherin蛋白表達，從而抑制體外培養SW480細胞的侵襲和轉移。

AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase)最是新發現的細胞內能量代謝的關鍵調節因子，通過感受細胞質內AMP/ATP比例變化調節新陳代謝，在應激過程中可抑制細胞增殖或提高細胞存活率，在癌癥治療和預防中的作用受到廣泛關注[18,19]。體內外研究發現，AMPK的激活將抑制熱休克因子-1(HSF1)活性，從而抑制胰腺癌細胞侵襲和轉移[20]；肝激酶B1(LKB1)磷酸化激活AMPK，可負調控腫瘤細胞增殖和代謝，且LKB1/AMPK信號通路參與腫瘤侵襲和轉移，是腫瘤向更高病理級別惡性進展的重要標志[21]。非甾體類抗炎藥阿司匹林可通過AMPK-mTOR-Akt/ERK軸抑制肝癌HepG2細胞和結腸癌SW480細胞增殖并誘導其凋亡[18]。槲皮素(quercetin)則能通過調節Sestrin2-AMPK-mTOR信號通路提高細胞內ROS水平，從而誘導HCT116結腸癌細胞凋亡[22]。另外，細胞周期素D1 (cyclin D1)在許多惡性腫瘤細胞生長中發揮關鍵作用[23]。cyclin D1的轉錄激活可以抑制順鉑對小鼠胰腺癌細胞的殺傷作用，即cyclin D1表達下調可抑制腫瘤生長[24]。咖啡豆醇通過ERK1/2、JNK和GKS3β依賴性蘇氨酸-286磷酸化誘導cyclin D1 蛋白酶體降解，從而抑制大腸癌HCT116、SW480細胞增殖[25]。大黃酚通過NF-κB/cyclin D1和NF-κB/Bcl-2信號通路級聯抑制乳腺癌細胞增殖并誘導細胞凋亡[8]。本研究結果表明，大黃酚可濃度依賴性地抑制人結腸癌SW480細胞的體外增殖、侵襲和體內腫瘤形成，促進移植瘤小鼠存活，其作用機制與介導AMPK依賴性信號通路有關。

本研究認為，大黃酚能劑量依賴性地下調增殖相關蛋白Ki67和PCNA表達，通過影響AMPK信號通路相關蛋白表達影響SW480細胞增殖；還能通過影響E-cadherin、VEGF、N-cadherin和Vimentin表達水平調控SW480細胞EMT能力。另外，體內實驗表明，大黃酚能促進荷瘤劑量組小鼠存活，降低腫瘤組織重量，影響Ki67、PCNA及AMPK信號通路蛋白表達，從而有效抑制腫瘤的體內形成。綜上所述，大黃酚能介導AMPK依賴性信號通路抑制結腸癌SW480細胞的增殖、侵襲和體內腫瘤形成，其可作為結腸癌的治療新型藥物。