魚腥草總黃酮對肺炎支原體感染小鼠Bcl-2和Bax表達的影響①

李向峰 陳文霞

(河南中醫藥大學第一臨床醫學院，鄭州 450000)

肺炎支原體肺炎(mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)主要由肺炎支原體引起，通常表現為間質性肺炎，發病機制復雜，與感染引起的上皮細胞凋亡和機體對肺炎支原體感染產生過度免疫應答有關，主要包括免疫細胞激活和細胞炎癥因子分泌[1-3]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6和干擾素-γ(IFN-γ)作為引起炎癥反應的主要細胞因子，與MMP的發生密切相關[4-6]。魚腥草總黃酮為中藥魚腥草的有效成分，具有抑菌作用，對肺炎有一定療效，但魚腥草總黃酮用于MPP鮮有報道[7-8]。本研究觀察魚腥草總黃酮對MMP治療治療鮮鼠肺組織病理的影響，檢測肺組織Bcl-2和Bax蛋白與mRNA表達水平，及血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，探討魚腥草總黃酮對MPP的抗感染作用及其作用機制，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級雄性BALB/c小鼠50只，4周齡，體質量18～22 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號：SYXK(豫)2015-0064。適應性飼養1周，自由飲水和攝食。

1.1.2試劑 MP標準菌株ATCC-15531購自美國ATCC公司，魚腥草總黃酮(1∶10)購自鄭州康吉元生物科技有限公司，支原體肉湯基礎培養基購自英國OXOID公司，Bcl-2和Bax引物由上海生物工程技術服務有限公司設計合成，TNF-α、IL-6和IFN-γ ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2方法

1.2.1動物分組與給藥 50只小鼠隨機分為對照組、模型組、魚腥草總黃酮低、中和高劑量組，每組10只。模型組、魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠建立MP感染模型，乙醚麻醉，鼻腔內接種30 μl MP菌液(1×107ccu/L)，1次/d，連續3 d。每組隨機挑選2只小鼠摘眼球取血，靜置15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，嚴格按照MP核酸檢測試劑盒說明書進行支原體檢測，陽性為造模成功[9]。魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠灌胃給予劑量為0.5、1.0、2.0 g/kg的魚腥草總黃酮，1次/d，連續7 d。對照組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水。

1.2.2標本采集 末次給藥后禁食不禁水12 h，稱取體質量，摘眼球取血，靜置15 min，3 000 r/min離心10 min，取上清，-80℃備用。分離小鼠左右兩側肺組織，稱取肺濕重，計算肺濕重指數：肺濕重指數=肺質量/體質量×100%，-80℃保存。

1.2.3HE染色觀察肺組織病理變化 取小鼠肺組織，10%甲醛固定48 h，洗滌，置于不同濃度的乙醇中梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚片，脫蠟，HE染色，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4Western blot檢測肺組織Bcl-2和Bax蛋白表達 取肺組織提取總蛋白，BCA法蛋白定量。取25 μl蛋白行SDS-PAGE電泳分離，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入Bcl-2和Bax一抗，4℃過夜，加入二抗(1∶5 000)，孵育1 h，化學發光發顯色。以β-actin為內參，進行蛋白條帶定量分析，計算灰度值。

1.2.5RT-PCR檢測肺組織Bcl-2和Bax mRNA表達 取小鼠肺組織制備細胞懸液，Trizol提取總RNA測定純度，以反轉錄產物為模板，1.4%瓊脂糖分別加入Bcl-2和Bax引物進行電泳，凝膠成像儀掃描定量，以目的基因與β-actin的產物電泳帶OD值比值作為目的基因的mRNA相對表達量。Bcl-2 F：5′-GACTTCGCCGAGATGTCCAG-3′；R：5′-CGGTGCTTGGCAATTAGTGG-3′，產物長度482 bp；Bax F：5′-ATGGAGCTGCAGAGGATT-3′；R：5′-AATGTCCAGCCCATGATGGTTC-3′，產物長度202 bp；β-actin F：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′；R：5′-CTCCTTAATTGTCACGCACAGTTC-3′，產物長度540 bp。反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環后72℃再延伸5 min。

1.2.6ELISA法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平 取小鼠血清，ELISA法檢測血清炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-γ水平，嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1各組小鼠肺濕重指數比較 與對照組相比，模型組小鼠肺濕重指數明顯升高(P<0.05)，與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺濕重指數明顯降低(P<0.05)，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺濕重指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組小鼠肺濕重指數

2.2各組小鼠肺組織病理情況 肺泡結構清晰，肺泡內無滲出。模型組小鼠肺組織出現間質性肺炎，肺泡腔變窄，肺泡間質可見炎癥細胞浸潤。魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織炎癥浸潤明顯減輕，且呈劑量依賴性。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色(×200)Fig.1 HE staining of lung tissues of mice in each group(×200)Note:A.Control group;B.Model group;C.Low dose group;D.Medium dose group;E.High dose group.

2.3各組小鼠肺組織Bcl-2和Bax蛋白表達水平 與對照組相比，模型組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖2。

2.4各組小鼠肺組織中Bcl-2和Bax mRNA表達水平 與對照組相比，模型組小鼠肺組織中Bcl-2 mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，Bax mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯降低(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)，Bax mRNA表達水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織Bcl-2和Bax mRNA表達水平Fig.3 Expression levels of Bcl-2 and Bax mRNA in lung tissues of mice in each groupNote:A.Control group;B.Model group;C.Low dose group;D.Medium dose group;E.High dose group.Compared with control group，*.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

2.5各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平 與對照組相比，模型組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)；與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，與魚腥草總黃酮低劑量組相比，魚腥草總黃酮中和高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，與魚腥草總黃酮中劑量組相比，魚腥草總黃酮高劑量組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平比較

3 討論

MPP的發病機制復雜，與毒素感染、上皮細胞黏附和免疫功能受損相關[10-12]。因此，臨床對MPP的機理研究主要集中于抗感染、上皮細胞調控和機體免疫調節等方面。Bcl-2家族通過與其他凋亡蛋白協同作用調控線粒體結構與功能，調節細胞凋亡[13]。抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax為Bcl-2家族成員，二者協同作用調控機體細胞凋亡。研究表明，Bcl-2過表達可保護細胞抵抗外界因素導致的凋亡，相反，當Bax過表達時，觸發Bax自我激活的級聯反應，使細胞膜通透性增加，促發細胞凋亡，Bcl-2/Bax比值大小對細胞受外界因素刺激后發生凋亡起關鍵作用[14，15]。本研究結果表明，與對照組相比，模型組小鼠肺組織Bcl蛋白和mRNA表達水平明顯降低，Bax蛋白和mRNA表達水平明顯升高，Bcl-2/Bax比值明顯降低，說明MP感染小鼠肺組織后，促進Bax表達，導致細胞凋亡。

MP感染導致機體免疫紊亂，發生炎癥浸潤，促使TNF-α、IL-6和IFN-γ等細胞炎癥因子釋放。TNF-α作為早期細胞炎癥因子，促使中性粒細胞釋放，誘導局部炎癥反應[16]。IL-6參與炎癥反應整個過程，是炎癥反應的重要介質，在機體免疫調節過程中起重要作用[17]。李容漢等[18]研究發現，MP感染后血清TNF-α和IL-6水平與感染程度呈正相關，其水平可準確反映患者病情。IFN-γ具有抗病毒、激活體液免疫的功能，主要由T細胞和NK細胞產生，其水平變化可反映MPP嚴重程度[19]。本研究結果表明，與對照組相比，模型組小鼠肺組織出現大量炎癥細胞浸潤，血清TNF-α、IL-6和IFN-γ水平明顯升高，說明MP感染激活機體免疫應答，促發炎癥反應。

MPP在中醫范疇屬于“肺風咳嗽”，病因為六淫時邪、正氣虧虛，臨床以清熱解毒止咳平喘為治則[20]。魚腥草具有清熱解毒、化痰消癰等功效，歸肺經、大腸經和膀胱經，是治療“肺癰”的要藥，主要有效成分為黃酮類。研究表明，魚腥草總黃酮具有抗氧化，抗病毒、抑菌、抗炎、提高免疫力等藥理作用[21，23]。本研究結果表明，與模型組相比，魚腥草總黃酮低、中和高劑量組小鼠肺組織Bcl-2表達水平明顯升高，Bax蛋白與mRNA表達水平明顯降低，Bcl-2/Bax比值明顯升高，說明不同劑量的魚腥草總黃酮均可上調Bcl-2蛋白表達，抑制Bax激活，阻止Bax作用于線粒體外膜，使Bcl-2/Bax比值升高，有效抑制細胞凋亡。

綜上所述，魚腥草總黃酮可減輕肺損傷，對MMP感染小鼠起抗感染作用，其作用機制可能與上調肺組織Bcl-2表達、下調Bax表達、降低血清炎癥因子水平有關。