LncRNA MALAT-1對彌漫性大B細胞淋巴瘤增殖和耐藥性的影響①

農衛霞 王 奎 龍珍珠瑪 王新華 王 燕

(新疆石河子大學醫學院第一附屬醫院血液風濕科，石河子 832000)

淋巴瘤是一類起源于淋巴造血系統的惡性腫瘤，主要分為霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤中最常見的類型，隨著醫療水平的發展，DLBCL患者的5年生存率和預后得到了顯著提升，但仍有約30%的患者死于復發或耐藥，因此深入闡明DLBCL的發病機制對其臨床治療具有重要意義[1,2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一類轉錄本長度超過200 bp 的非編碼RNA，主要從表觀遺傳、染色體重塑、轉錄以及轉錄后等不同水平上調控基因的表達，并在腫瘤的發生發展中起重要作用[3,4]。肺腺癌轉移相關轉錄因子1(metastasis-associated lung adenocarci-noma transcript 1,MALAT-1)是在非小細胞肺癌患者中發現的首個與腫瘤轉移相關的LncRNA，近來研究顯示MALAT-1在乳腺癌、結腸癌、肝癌等多種腫瘤中呈異常表達，并影響腫瘤的發展和預后[5,6]。本研究旨在探討LncRNA MALAT-1對DLBCL增殖和耐藥性的影響。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 收集2015年3月至2018年11月我院收治的DLBCL患者的淋巴組織標本81例，其中男性50例，女性31例；年齡19～83歲，平均年齡(52.1±6.6)歲。根據Ann Arbor分期標準分為：Ⅰ期15例，Ⅱ期22例，Ⅲ期27例，Ⅳ期17例；有B癥狀(不能解釋的發熱>38℃；盜汗；皮膚瘙癢；體質量減輕等)29例，無B癥狀52例；根據非霍奇金淋巴瘤國際預后指數(IPI)評分標準：0～1分19例，2分26例，3～5分36例；乳酸脫氫酶(LDH)>300 U/L 43例，<300 U/L 38例。納入標準：①所有患者經組織病理學確診為DLBCL；②所有患者術前均未接受任何放、化療治療；③所有患者病歷資料完整并簽署知情協議書；④排除合并心肝腎等重大器官疾病及其他惡性腫瘤患者。另選取60例經病理檢測確診為非DLBCL患者的健康淋巴組織作為對照組。

1.1.2試劑 DLBCL細胞系OCI-Ly8購自南京科佰生物科技有限公司。RNAprep pure動物組織總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司。PrimeScriptTMRT reagent Kit反轉錄試劑盒、SYBR Premix EX Taq熒光定量試劑均購自日本TaKaRa公司。Cell Counting Kit-8細胞增殖試劑盒購自碧云天生物技術公司。阿霉素(Doxorubicin)購自北京索萊寶科技有限公司。MDR1和MRP1兔多克隆抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR 采用組織RNA提取試劑盒分離DLBCL組織和正常淋巴組織中的總RNA，采用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。根據NCBI中查詢到的人MALAT-1核酸序列設計RT-PCR引物為：MALAT-1-F：5′-GGTCTCTGTGTCTTCGGAG-3′，MALAT-1-R：5′-GGAAAACGCCTCAAT-CCCAC-3′。同時取人GAPDH基因作為內參，GAPDH-F：5′-CACTGCCAACGTGTCAGTG-3′，GAPDH-R：5′-GAC-AAAGTGGTCGTTGAGGG-3′。根據RT-PCR試劑盒說明書配置反應體系，設置RT-PCR反應程序為：95℃預變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環。反應結束后采用2-ΔΔCt法計算MALAT-1 mRNA的相對表達含量。

1.2.2慢病毒穩定細胞系構建 pGLVH1-GFP-MALAT-1-shRNA和pGLVH1-GFP-NC-shRNA慢病毒干擾載體由上海吉瑪制藥技術有限公司構建。分別將MALAT-1-shRNA或NC-shRNA慢病毒表達載體與包裝質粒Helper vector-Ⅰ、Helper vector-Ⅱ、Helper vector-Ⅲ共轉染HEK293T細胞，轉染6 h后換液，48 h后離心取上清，0.45 μm過濾器過濾，將病毒上清分別加入至指數生長期的DLBCL細胞系OCI-Ly8中培養。48 h后換液并加入1 μg/ml的嘌呤霉素(根據細胞死亡情況調整給藥濃度)，直至熒光顯微鏡下所有細胞均表達綠色熒光時表明細胞系構建成功。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖 MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養至對數生長期后，胰酶消化，重懸，計數，取100 μl(5×104個細胞)接種到96孔板內，繼續培養24 h。分別于第24 h、36 h、48 h和72 h向各組細胞加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育4 h。不同細胞在各時間點均設置3個復孔。酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.2.4細胞耐藥性檢測 MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養至對數生長期后，胰酶消化，重懸，計數，取100 μl(1×105個細胞)接種到96孔板內，每組細胞設置3個復孔。細胞貼壁后更換培養基，NC-shRNA組和MALAT-1-shRNA組細胞分別加入200 ng/ml的阿霉素，另取一組NC-shRNA細胞加入等體積的PBS作為對照組。避光培養48 h，培養結束前4 h孔內加入10 μl CCK-8溶液，繼續孵育4 h。酶標儀450 nm處檢測各孔吸光度值，根據吸光度值計算各組細胞存活率。

1.2.5Western blot實驗 MALAT-1-shRNA組和NC-shRNA組OCI-Ly8細胞培養至對數生長期，取2 ml(1×106個細胞)接種到6孔板內，每組細胞設置3個復孔。繼續培養48 h。收集細胞，加入RIPA裂解液在冰上裂解30 min，12 000 g離心20 min，取上清。SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，加入MDR1(1∶2 000稀釋)和MRP1(1∶1 000稀釋)抗體，4℃孵育過夜。PBST洗滌3次，羊抗兔二抗(1∶5 000稀釋)室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，ECL發光液顯影。

2 結果

2.1MALAT-1在DLBCL組織和健康淋巴組織中的表達 健康淋巴組織和DLBCL組織中LncRNA MALAT-1的mRNA相對表達水平分別為0.41±0.08和1.46±0.11，LncRNA MALAT-1在DLBCL組織中的相對表達水平顯著高于健康淋巴組織，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 DLBCL組織和健康淋巴組織中LncRNA MALAT-1 的相對表達水平Fig.1 Relative expression level of LncRNA MALAT-1 in DLBCL and healthy lymphoid tissueNote:*.P<0.05.

2.2LncRNA MALAT-1下調對DLBCL細胞增殖的影響 CCK-8檢測顯示，與NC-shRNA組相比，MALAT-1-shRNA組細胞在24 h、36 h、48 h以及72 h 的增殖能力均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 MALAT-1對DLBCL細胞增殖能力的影響Fig.2 Effect of MALAT-1 on proliferation of DLBCL cellsNote:Compared with NC-shRNA,*.P<0.05.

2.3MALAT-1下調對DLBCL細胞耐藥性的影響 加入Adriamycin的細胞增殖結果顯示，NC-shRNA組、MALAT-1-shRNA組、NC-shRNA+Adri-amycin組和MALAT-1-shRNA+Adriamycin組曲線的平均斜率分別為0.46±0.07、0.27±0.09、0.29±0.08和0.11±0.04。與NC-shRNA組比較，MALAT-1-shRNA組增殖曲線的平均斜率下降；與NC-shRNA組、MALAT-1-shRNA組和NC-shRNA+Adriamycin組比較，MALAT-1-shRNA+Adriamycin組增殖曲線的平均斜率下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 MALAT-1下調對DLBCL細胞耐藥性的影響Fig.3 Effect of down-regulation of MALAT-1 on retina of DLBCL cellsNote:Compared with MALAT-1-shRNA+Adriamycin,*.P<0.05.

2.4MALAT-1下調對相關耐藥基因表達的影響 Western blot檢測結果顯示，與NC-shRNA組MDR1和MRP1的蛋白表達水平1.10±0.21、1.34±0.18比較，MALAT-1-shRNA組細胞中MDR1和MRP1的蛋白表達水平0.45±0.12、0.78±0.17顯著下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 MALAT-1對相關耐藥基因MDR1和MRP1表達的影響Fig.4 Effect of MALAT-1 on expression of MDR1 and MRP-1

3 討論

MALAT-1是一種定位于人類染色體11q13.1，全長約8 000 bp的LncRNA，在哺乳動物中高度保守，并且具有明顯的器官表達差異性和時間表達差異性[7]。作為LncRNA家族中重要的一員，MALAT-1已被證明在轉錄調控、表觀遺傳、細胞周期調控、炎癥反應以及腫瘤轉移等機制中發揮著不同的作用[8,9]。研究顯示，MALAT-1在多種腫瘤組織中的表達量顯著高于正常組織，并與腫瘤轉移相關。如MALAT-1在非小細胞肺癌組織中表達增加，對有可能發生轉移的高風險早期非小細胞肺癌患者的臨床診斷具有重要意義[10]；Yao等[11]的研究顯示MALAT-1在食管癌組織中高表達，并且與患者預后相關，敲低MALAT-1可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲[11]；Gao等[12]的研究則表明MALAT-1通過上調HMGB1的表達從而促進多發性骨髓瘤細胞的自噬，并抑制腫瘤細胞的凋亡。本研究結果顯示，與健康淋巴組織相比，DLBCL組織中MALAT-1的mRNA相對表達水平顯著增加，提示MALAT-1可能在DLBCL的發生及進展中扮演重要角色。

為了進一步探究MALAT-1在DLBCL中可能的作用途徑，本研究構建了MALAT-1-shRNA慢病毒穩定細胞系，隨后用CCK-8法檢測MALAT-1敲低后對DLBCL細胞增殖和耐藥性的影響。結果顯示，人為降低MALAT-1的表達后，DLBCL細胞的增殖能力受到顯著抑制。耐藥實驗則顯示，DLBCL一線化療藥物阿霉素處理細胞后，MALAT-1-shRNA組細胞在各時間點的增殖活力均顯著低于NC-shRNA組，提示沉默MALAT-1的表達可大幅提高阿霉素的殺傷效果，降低DLBCL細胞對阿霉素化療的抵抗效應。

阿霉素主要通過嵌入腫瘤細胞的DNA堿基，阻礙DNA的轉錄和RNA的合成，從而促進細胞的凋亡、自噬或壞死，但阿霉素的長期使用也會使腫瘤細胞對其產生耐藥性[13]。部分ABC轉運蛋白介導的多藥耐藥(mutiple drug resistance，MDR)是腫瘤細胞耐藥機制中的重要途徑[14]。ABC家族的主要成員如多藥耐藥基因1(multi-drug resistance gene 1,MDR1)、多藥耐藥相關蛋白(multi-drug resistance-associated protein,MRP1)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)等均在阿霉素誘導的腫瘤細胞耐藥中起關鍵作用[15,16]。研究顯示MDR1、MRP1和BCRP蛋白在白血病、乳腺癌、肺癌以及DLBCL等多種惡性腫瘤中存在原發性高表達，并與患者的化療效果和預后密切相關[17,18]。本研究發現，與NC-shRNA組比較，MALAT-1-shRNA組細胞中MDR1和MRP1的蛋白表達水平顯著下調，提示MALAT-1的下調可顯著抑制DLBCL細胞中MDR1和MRP1的表達，MALAT-1參與DLBCL中MDR1和MRP1介導的耐藥調控。

綜上所述，MALAT-1在DLBCL組織高表達，沉默MALAT-1可顯著抑制DLBCL腫瘤細胞的增殖和耐藥性，有望為DLBCL的早期診斷、臨床化療以及預后評估提供重要的參考。