miR-490-5p靶向SP1抑制骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展①

余孟英 王金蓮 陳 路 蒲勁松

(川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨科，南充 637000)

骨肉瘤是最常見的主要發(fā)生于兒童和青少年的原發(fā)性骨惡性腫瘤，通常出現(xiàn)在長骨的末端，主要發(fā)生在膝蓋處[1]。該病屬于第八大癌癥，發(fā)病率高，且被診斷為骨肉瘤的兒童的5年生存率低于30%，10年生存率低于50%，嚴(yán)重威脅家庭和社會安定[2]。雖然近幾年骨肉瘤的治療策略取得了一些進(jìn)展，但仍然存在預(yù)后差等問題。基因水平的治療一直是骨肉瘤的研究熱點(diǎn)。已有研究表明miR-490-5p能夠抑制肝癌、膀胱癌、人肝內(nèi)膽管癌等癌癥的發(fā)生和發(fā)展，但其對骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的作用尚不清楚[3-5]。SP1屬于kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子家族，是一種廣泛參與細(xì)胞凋亡、生長、代謝和分化的鋅指轉(zhuǎn)錄因子，在肺癌、結(jié)直腸癌和胃癌等癌癥中表達(dá)均升高，并導(dǎo)致多種致癌基因的表達(dá)，已有報(bào)道顯示SP1可促進(jìn)骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。本文主要研究miR-490-5p對骨肉瘤細(xì)胞生長和運(yùn)動的作用，以期為骨肉瘤的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞系 正常成骨細(xì)胞株hFOB1.19和骨肉瘤細(xì)胞MG63購自美國ATCC細(xì)胞庫。

1.1.2試劑 RPMI1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自德國PAN公司，mimic-NC、miR-490-5p mimic、SP1質(zhì)粒購自上海生物工程有限公司，Lipofectamine 2000購自美國 Invitrogen 公司，Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒購自美國 Promega 公司，BCA試劑盒購自北京天根生化有限公司。

1.1.3動物 24只裸鼠購自四川夏派森醫(yī)藥科技有限公司，許可證號：SYXK(川)2017-203。裸鼠在25℃，12 h光照/12 h黑暗循環(huán)的飼養(yǎng)室，自由獲取水和食物。在實(shí)驗(yàn)前1周開始適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.1.4儀器 MD全自動顯微鏡購自美國Molec-ular Devices公司；超凈工作臺購自蘇州凈化設(shè)備廠。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人骨肉瘤MG63細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下，培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。實(shí)驗(yàn)設(shè)置control組、mimic-NC組、miR-490-5p mimic組、SP1組、mimic+SP1組。根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入各組骨肉瘤MG63細(xì)胞。

1.2.2RT-qRCR檢測miR-490-5p和SP1的表達(dá) 將細(xì)胞收集后用TRIzol裂解液抽提總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行RT-qPCR檢測。本實(shí)驗(yàn)所用引物序列：miR-490-5p F：5′-GCAAACAACCAUUCGGCUGUC-3′，R：5′-CGCAGGTCCGGAGTAGGT-3′;SP1 F:5′-TGGTGGGCAGTA-TGTTGT-3′，SP1 R:5′-GCTATTGGCATTGGTG-AA-3′;GAPDH F：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′，GAPDH R：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′。

1.2.3靶基因預(yù)測運(yùn)用基因預(yù)測軟件 TargetScan軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-128-3p的靶基因。

1.2.4雙熒光素酶活性測定靶向關(guān)系 以海腎熒光素酶的熒光值作為內(nèi)參，按照Dual Luciferase報(bào)告基因試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5MTT法檢測細(xì)胞增殖 將胰蛋白酶消化的MG63細(xì)胞懸浮液按2×103個/孔加入96孔板，待細(xì)胞生長至50%時(shí)，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，加入血清，在不同時(shí)間加入MTT，再培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基加入DMSO，上機(jī)測定A570，代表細(xì)胞活力。

1.2.6Western blot檢測Ki67、PCNA、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、E-cadherin和N-cadherin表達(dá) 用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，經(jīng) SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，然后加入一抗在4℃封閉過夜，再加入對應(yīng)二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光。

1.2.7Transwell檢測細(xì)胞侵襲將細(xì)胞 以無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，用胰蛋白酶消化以3×105個/ml傳代接種于用Matrigel預(yù)處理的Transwell小室中，小室上層加入無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，下層則加入含血清的正常培養(yǎng)液，48 h后用無菌棉簽擦去小室上層細(xì)胞，下層細(xì)胞HE染色后計(jì)數(shù)。

1.2.8劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將各組骨肉瘤MG63細(xì)胞消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養(yǎng)基，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，顯微鏡下拍照，Image J 軟件分析。

1.2.9裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 將裸鼠隨機(jī)分為Control組和miR-490-5p mimic組，每組 12只，雌雄各半。各組裸鼠右后肢腹側(cè)皮下注射 0.2 ml 1×107個/ml骨肉瘤MG63細(xì)胞和轉(zhuǎn)染miR-490-5p mimic的骨肉瘤MG63細(xì)胞懸液。SPF條件下正常飲食飼養(yǎng)，觀察裸鼠皮下成瘤情況。第 30 天頸椎脫位法處死裸鼠，完整取出皮下腫瘤，電子天平稱重，Western blot檢測Ki67、Bax、caspase-3、E-cadherin蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1miR-490-5p在骨肉瘤細(xì)胞MG63中低表達(dá) 與正常hFoB1.19細(xì)胞相比，骨肉瘤細(xì)胞MG63中miR-490-5p的表達(dá)量明顯下調(diào)(P<0.01，圖1A)，說明miR-490-5p在骨肉瘤細(xì)胞MG63中低表達(dá)。

2.2miR-490-5p mimic上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞MG63 miR-490-5p 的表達(dá) RT-qPCR結(jié)果顯示，與Control組骨肉瘤MG63細(xì)胞中miR-490-5p的表達(dá)量相比，mimic-NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明空載質(zhì)粒對骨肉瘤MG63細(xì)胞中miR-490-5p表達(dá)無影響，而miR-490-5p mimic組miR-490-5p表達(dá)量明顯上調(diào)(P<0.01，圖1B)，說明miR-490-5p mimic質(zhì)粒有效，能上調(diào)骨肉瘤細(xì)胞MG63 miR-490-5p表達(dá)。

圖1 RT-qRCR檢測miR-490-5p表達(dá)水平Fig.1 miR-490-5p mRNA expression level was detected by RT-qRCRNote:A.**.P<0.01 versus hFOB1.19 cells;B.**.P<0.01 versus control group.

2.3miR-490-5p靶向作用SP1 3′-UTR 通過基因預(yù)測軟件和Pubmed篩選出SP1作為 miR-490-5p的靶基因，miR-490-5p與SP1在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)(圖2A)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明，miR-490-5p對野生型SP1表達(dá)有明顯下調(diào)作用，對突變型無明顯作用，提示 miR-490-5p直接靶向作用于SP1(P<0.01，圖2C)。SP1的表達(dá)結(jié)果表明，與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞SP1表達(dá)水平無明顯變化，miR-490-5p mimic組SP1表達(dá)量顯著下調(diào)，SP1組SP1表達(dá)量顯著上調(diào)，說明空載質(zhì)粒對細(xì)胞SP1表達(dá)無影響，miR-490-5p mimic對SP1具有抑制作用，pcDNA-SP1能使SP1過表達(dá)；mimic+SP1組SP1表達(dá)，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著上調(diào)，比SP1組顯著下調(diào)，說明 miR-490-5p和SP1具有靶向關(guān)系，并且過表達(dá) miR-490-5p抑制SP1表達(dá)(P<0.01，圖2B、D)。

圖2 miR-490-5p靶向作用于SP1Fig.2 miR-490-5p targets to SP1Note:A.Target genes of miR-490-5p were screened by the gene prediction software TargetScan;B.Expression of SP1 was detected by RT-qRCR;C.Targeting relationship was detected by luciferase activity;D.Expression of SP1 was detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.4miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖 與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞生長速度無明顯變化，miR-490-5p mimic組細(xì)胞生長速度明顯下降，SP1組細(xì)胞生長速度明顯升高(P<0.01，圖3A)，說明空載質(zhì)粒對細(xì)胞生長速度無影響，miR-490-5p mimic抑制細(xì)胞MG63增殖，pcDNA-SP1促進(jìn)細(xì)胞MG63增殖；mimic+SP1組細(xì)胞MG63生長速度與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯增多，比SP1組明顯下降，說明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖(P<0.01，圖3A)。與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞Ki67和表PCNA表達(dá)量顯著下調(diào)，SP1組Ki67和PCNA表達(dá)量顯著上調(diào)，說明空載質(zhì)粒對細(xì)胞Ki67和PCNA表達(dá)無影響，miR-490-5p 過表達(dá)抑制Ki67和PCNA表達(dá)，SP1過表達(dá)促進(jìn)Ki67和PCNA1表達(dá)(P<0.01，圖3B)；mimic+SP1組Ki67和PCNA表達(dá)量，與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯上調(diào)，比SP1組明顯下調(diào)，說明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖(P<0.01，圖3B)。

圖3 各組細(xì)胞增殖情況Fig.3 Cell proliferation in each groupNote:A.Cell proliferation was detected by MTT;B.Ki67 and PCNA protein expressions were detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.5miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡 與Control組相比，mimic-NC組細(xì)胞Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)水平無明顯變化，miR-490-5p mimic組Bcl-2表達(dá)量明顯下調(diào)，Bax、caspase-3和caspase-9明顯上調(diào)，SP1組Bcl-2表達(dá)量明顯上調(diào)，Bax、caspase-3和caspase-9明顯下調(diào)，提示空載質(zhì)粒對細(xì)胞MG63凋亡無影響，miR-490-5p 過表達(dá)可能抑制細(xì)胞MG63凋亡，SP1過表達(dá)可能促進(jìn)細(xì)胞MG63凋亡(P<0.01，圖4)；mimic+SP1組Bcl-2表達(dá)與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯上調(diào)，比SP1組明顯下調(diào)，mimic+SP1組Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)，與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組明顯下調(diào)，比SP1組明顯上調(diào)，提示miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1可能促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡(P<0.01，圖4)。

圖4 Western blot檢測Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)水平Fig.4 Detection of Bcl-2,Bax,caspase-3 and caspase-9 expression levels by Western blotNote:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.6miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63侵襲 與Control組相比，mimic-NC組侵襲細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，miR-490-5p mimic組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少，SP1組侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著增多，說明空載質(zhì)粒對MG63細(xì)胞侵襲能力無影響，miR-490-5p 過表達(dá)對MG63細(xì)胞侵襲具有抑制作用，SP1過表達(dá)促進(jìn)MG63細(xì)胞侵襲；mimic+SP1組侵襲細(xì)胞數(shù)目與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著增多，比SP1組顯著減少，說明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63侵襲(P<0.01，圖5)。

2.7miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63遷移 與Control組相比，mimic-NC組劃痕寬度和愈合率無明顯變化，miR-490-5p mimic組劃痕顯著增寬、愈合率顯著降低，SP1組劃痕顯著變窄、愈合率顯著升高，說明空載質(zhì)粒對MG63細(xì)胞遷移速度無影響，miR-490-5p 過表達(dá)對MG63細(xì)胞遷移速度具有抑制作用，SP1過表達(dá)促進(jìn)MG63細(xì)胞遷移能力；mimic+SP1組侵襲愈合率與Control組和mimic-NC組相比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著升高，比SP1組顯著降低，說明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63遷移(P<0.01，圖6)。

圖6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力(×400)Fig.6 Migration ability of each group was tested by scratch test(×400)Note:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.8miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 與Control組相比，mimic-NC組E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)無明顯變化，miR-490-5p mimic組E-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，N-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)；SP1組E-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)，N-cadherin表達(dá)顯著上調(diào)，說明空載質(zhì)粒對MG63細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化無影響，miR-490-5p 過表達(dá)對MG63細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有抑制作用，SP1過表達(dá)促進(jìn)MG63細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；mimic+SP1組E-cadherin表達(dá)，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著下調(diào)，比SP1組顯著上調(diào)；mimic+SP1組N-cadherin表達(dá)，與Control組和mimic-NC組比無明顯變化，比 miR-490-5p mimic組顯著上調(diào)，比SP1組顯著下調(diào)，說明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(P<0.01，圖7)。

圖7 Western blot檢測E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)Fig.7 Expression levels of E-cadherin and N-cadherin were detected by Western blotNote:**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.9miR-490-5p過表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63體內(nèi)生長和運(yùn)動 30 d后，與Control組相比，miR-490-5p mimic組腫瘤重量顯著減輕，說明miR-490-5p過表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的發(fā)生和發(fā)展(P<0.01，圖8A)。與Control組相比，miR-490-5p mimic組Ki67、Bax和caspase-3表達(dá)顯著下降，E-cadherin表達(dá)顯著升高，說明miR-490-5p過表達(dá)抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63體內(nèi)增殖和上皮間質(zhì)化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(P<0.01，圖8B)。

圖8 裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of nude mouse in vivo experimentNote:A.Tumor weight statistics;B.Expression levels of Ki67，Bax，caspase-3 and E-cadherin were detected by Western blot.**.P<0.01 versus control group.

3 討論

miRNA在癌癥中異常表達(dá)，可作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用[7]。如miR-302a在人骨肉瘤細(xì)胞中低表達(dá)，并抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-490-5p在腎細(xì)胞癌中低表達(dá)，并通過靶向PIK3CA抑制腎細(xì)胞癌細(xì)胞生長[9]。本研究發(fā)現(xiàn)骨肉瘤組織中miR-490-5p表達(dá)水平低于非癌組織，提示miR-490-5p可能作為腫瘤抑制因子參與骨肉瘤發(fā)病。

SP1 基因位于人染色體第 12q13.1 區(qū)域，由 788 個殘基組成，參與幾乎所有的細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡和分化[10]。SP1是一種促癌蛋白，在腫瘤組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，且與腫瘤的浸潤程度呈正相關(guān)，而下調(diào)SP1能抑制癌細(xì)胞形成腫瘤[11]。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-335通過靶向SP1調(diào)控人骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖[12]。本研究發(fā)現(xiàn)miR-490-5p和SP1具有靶向關(guān)系，并與SP1在3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，并且miR-490-5p過表達(dá)抑制SP1表達(dá)，從而抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的生長和運(yùn)動。

骨肉瘤作為常見的原發(fā)性惡性腫瘤，其發(fā)生、發(fā)展是多步驟、多階段、多因素共同參與的結(jié)果，而細(xì)胞過度增殖是其生理功能最突出的變化[13]。因此，有效抑制細(xì)胞增殖是骨肉瘤治療的關(guān)鍵。已有報(bào)道m(xù)iR-490-5p過表達(dá)能夠抑制肝癌細(xì)胞的增殖，因此，miR-490-5p過表達(dá)有望抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖。而腫瘤的發(fā)生不僅是因?yàn)榧?xì)胞的增殖速度快，而且和細(xì)胞的凋亡速度息息相關(guān)。因此，干預(yù)細(xì)胞凋亡是骨肉瘤治療的關(guān)鍵。Xu等[15]報(bào)道m(xù)iR-490-5p過表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，因此，miR-490-5p過表達(dá)有望誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。本研究證明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞MG63凋亡。

骨肉瘤患者癥狀為短期疼痛和腫脹，剛發(fā)病時(shí)易被忽略，因此，一般就診時(shí)癥狀已經(jīng)持續(xù)了較長時(shí)間[16]。而由于骨肉瘤具有高度侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的潛能，所以通常確診時(shí)約85%的骨肉瘤患者已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移[17]。骨肉瘤早期及術(shù)后易發(fā)生血源性轉(zhuǎn)移，最常見于肺，其次為其他身體組織和器官，這往往是造成癌癥患者死亡的主要原因[18]。因此，有效抑制細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移速度是骨肉瘤治療的關(guān)鍵切入點(diǎn)之一。已有研究報(bào)道m(xù)iR-490-5p通過直接調(diào)控ROBO1抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，因此，miR-490-5p過表達(dá)有望抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[19]。本研究證明miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63的侵襲和遷移。在轉(zhuǎn)移進(jìn)展過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化驅(qū)動原發(fā)性上皮樣腫瘤細(xì)胞獲得侵襲性間充質(zhì)表型，活動性和侵襲性增強(qiáng)，最終通過直接的局部組織浸潤或通過血管和淋巴管發(fā)生轉(zhuǎn)移[20]。因此，骨肉瘤中控制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是一種有效抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移和提高癌癥患者生存率的策略。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

通過體外實(shí)驗(yàn)可知，miR-490-5p過表達(dá)靶向SP1抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63生長和運(yùn)動。相比單一的外部環(huán)境，生物體內(nèi)環(huán)境是極其復(fù)雜多變的，為了更好地了解miR-490-5p對骨肉瘤細(xì)胞生長和運(yùn)動的影響，本研究進(jìn)行了裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)miR-490-5p過表達(dá)可減輕小鼠骨肉瘤，抑制骨肉瘤細(xì)胞MG63體內(nèi)增殖和上皮間質(zhì)化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-490-5p靶向SP1對骨肉瘤細(xì)胞MG63生長和運(yùn)動起調(diào)節(jié)作用，主要誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。這說明miR-490-5p在骨肉瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有重要作用，但其是否為骨肉瘤治療靶點(diǎn)還有待進(jìn)一步研究。