PD-L1和IFN-ɑ與系統性紅斑狼瘡患者免疫功能異常的關系研究①

廖永強 孟 芳 肖 妮 夏洪嬌 劉劍榮 彭可君 俞丹菁 戴森華

(江西省萍鄉市人民醫院，萍鄉 337000)

系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是以產生多種身抗體為特征的自身免疫性疾病，其主要臨床特征為免疫功能紊亂[1]。細胞抗原分子表達失調、信號傳導、基因轉錄錯誤及細胞因子共同作用促使SLE患者細胞和體液免疫功能紊亂[2]。體外研究表明，程序性死亡蛋白1(program-med death 1,PD-1)與程序性死亡蛋白配體1(program-med death ligand-1,PD-L1)相互作用抑制SLE患者及健康志愿者T淋巴細胞增殖和細胞因子產生，而IFN-α可反向調節PD-L1表達[3，4]。另有研究顯示，IFN-α可促進Th17細胞分化，誘導B淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator,BLyS)產生，促進B細胞活化產生致病性自身抗體[5]。體外研究提示IFN-α反向調節PD-L1表達，但在SLE患者體內PD-L1和IFN-α與免疫功能的關系尚不明確。本文擬檢測抗dsDNA抗體陽性和陰性SLE患者淋巴細胞表面和血清IFN-α、PD-1/PD-L1表達水平，分析PD-L1和IFN-α與免疫功能及疾病活動相關性，旨在探討PD-L1及IFN-α與免疫功能的關系。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1研究對象 選取2018年1月～2019年12月于我院就診的SLE患者52例，其中男性1例，女性51例，平均年齡(47.4±20.6)歲，記作SLE組，所有患者均符合美國類風濕病學會2009年修訂的SLE診斷標準，活動性判定以SLEDAI-2000為標準[6，7]。間接免疫熒光法檢測抗dsDNA抗體，根據檢測結果將SLE患者分為抗dsDNA陽性組(18例)和陰性組(34例)，平均年齡分別為(38.6±14.3)歲和(42.9±16.1)歲。另選取同期于我院體檢的健康志愿者48例作為健康對照組(HC組)，其中男性7例，女性41例，平均年齡(36.8±12.4)歲，無自身免疫性疾病，心肌酶譜、肝、腎功能正常。收集所有研究對象的靜脈血血清于-80℃保存備用。

1.1.2試劑與儀器 抗dsDNA試劑盒購自歐蒙醫學診斷有限公司(中國)；PD-L1與IFN-α血清檢測試劑盒購自R&D Systems China；小鼠抗人 IgG1-FITC、IgG1-PE、CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、CD19-FITC、紅細胞裂解液、補體C3、C4檢測試劑盒、FC500流式細胞儀和IMMAGE800特定蛋白儀均購自貝克曼庫爾特公司(中國)；小鼠抗人PD-L1-PE、PD-1-PE單克隆抗體購自Abcam中國公司CRP檢測試劑盒購自利德曼生化股份有限公司。

1.2方法

1.2.1SLE患者和健康對照組CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞及CD19+B細胞表面PD-1、PD-L1分子檢測 所有研究對象早晨空腹外周靜脈EDTA-K2抗凝采血2.5 ml；每個流式管加入50 μl全血，分別加入相應量的目的抗體震蕩混勻，常溫下避光反應20 min；加入200 μl紅細胞裂解液后常溫裂解紅細胞直至液體變清；加磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 800 r/min離心5 min；棄上清，加0.5 ml PBS，流式細胞術檢測。

1.2.2SLE患者和健康對照組血清PD-L1、IFN-α及疾病活動度指標檢測 抗dsDNA抗體滴度檢測采用ELISA法、定性檢測采用間接免疫熒光法；PD-L1與IFN-α血清水平檢測采用ELISA法；補體C3、C4檢測采用速率散射比濁法；利用全自動生化分析儀免疫比濁法檢測CRP。所有檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1一般資料及臨床特征 SLE患者及健康志愿者的一般資料及抗核抗體檢檢測情況與臨床特征見表1。

表1 SLE患者和健康志愿者一般資料Tab.1 General information of SLE patients and healthy volunteers

2.2SLE組和HC組CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞和CD19+B細胞表面PD-1和PD-L1分子表達 PD-1在抗dsDNA抗體陽性和陰性SLE患者外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞和CD19+B細胞表達水平均顯著高于HC組(P<0.01),且陽性組均顯著高于陰性組(P<0.01)，結果見表2。PD-L1在CD3+CD4+T細胞上表達水平顯著高于HC組(P<0.01)，且陽性組顯著高于陰性組(P<0.01)，而在CD8+T細胞和CD19+B細胞表面PD-L1分子表達顯著低于陰性組和HC組(P<0.01)，結果見表3。

表2 SLE組和HC組淋巴細胞亞群表面PD-1陽性表達率Tab.2 Positive rate of PD-1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

表3 SLE組和HC組淋巴細胞亞群表面PD-L1陽性表達率Tab.3 Positive rate of PD-L1 expression in lymphoid subsets of SLE and HC

2.3SLE患者和HC組血清PD-L1、IFN-α及疾病活動度指標的比較 抗dsDNA抗體陽性組血清PD-L1表達水平顯著低于陰性組和HC組(P<0.01)，而IFN-α顯著高于陰性組和HC組(P<0.01)，兩者在陰性組和HC組間無顯著性差異(P>0.05)。陽性組SLE患者SLEDAI、血清抗dsDNA抗體滴度和CRP均顯著高于陰性組和HC組(P<0.01)，補體C3、C4水平顯著低于陰性組和HC組(P<0.01，表4)。

表4 SLE組和HC組血清PD-L1、IFN-α水平和疾病活動性相關指標的比較Tab.4 Comparison of serum levels of PD-L1，IFN-α and disease activity indexes between SLE and HC

2.4SLE患者血清PD-L1與IFN-α和疾病活動度指標的相關性 SLE患者血清PD-L1、IFN-α及其與疾病活動度指標的相關性分析顯示，PD-L1與IFN-α、SLEDAI、抗dsDNA抗體滴度和CRP呈負相關，與補體C3和C4呈正相關(P<0.05，圖1)。

圖1 SLE患者PD-L1與疾病活動性指標的相關性分析Fig.1 Correlation between PD-L1 and disease activity indexs in patients with SLE

3 討論

SLE是一種自身免疫性疾病，細胞和體液免疫異常導致多種自身抗體產生，對多器官造成損傷。SLE患者免疫功能紊亂可能是體外環境誘導、遺傳因素和體內細胞因子共同作用的結果，但其具體機制尚不明確[8]。PD-1/PD-L1共刺激分子在自身免疫性疾病的發生發展中發揮重要作用，PD-1與PD-L1結合后可以傳遞負性信號，降低T細胞活化程度及炎癥反應程度[9]。PD-1與PD-L1結合還與免疫耐受相關，動物實驗發現PD-1或PD-L1基因敲除小鼠易發展出自身免疫性疾病[10]。有研究表明，SLE患者外周血PD-1+CD3+T細胞和CD19+B細胞顯著升高，PD-L1+CD19+B 細胞和 PD-L2+CD14+單核細胞顯著升高[11]。 付文哲等[12]研究發現，PD-1在SLE患者外周血T、B細胞表達上調，而PD-L1在SLE患者外周血B細胞和單核細胞表達上調。本研究發現，PD-1在SLE患者外周血CD4+T、CD8+T細胞和CD19+B細胞表面表達均上調，且陽性組高于陰性組，和以上文獻報道一致，提示活動期SLE患者淋巴細胞處于活化狀態。PD-L1在SLE患者外周血CD4+T表面表達顯著升高，且陽性組高于陰性組，提示當CD4+T細胞過度活化時，機體通過其他信號通路產生細胞因子促進PD-L1表達從而平衡體內細胞免疫，其原因可能與PD-1/PD-L1參與免疫耐受有關，與本文結果陽性組SLE患者血清IFN-α表達顯著升高相符。本研究發現抗dsDNA抗體陽性SLE患者CD8+T細胞和CD19+B細胞表面PD-L1分子顯著低于陰性組和HC組。PD-L1 組成性表達于T、B淋巴細胞。SLE患者B細胞表面PD-L1表達減少，理論上導致PD-L1 /PD-1通路傳遞給T細胞的負信號減弱，從而使T細胞持續激活，激活的T細胞可輔助B細胞激活，其中可能包括自身反應性B細胞，后者過度分泌自身抗體最終加重SLE 病情，與謝長好等[13]報道一致。SLE患者CD8+T細胞表面PD-L1分子表達下調，可能與SLE患者發生病毒感染相關，PD-L1分子表達下調使CD8+T細胞活化殺傷病毒，與本課題前期研究一致[14]。

當SLE患者免疫功能紊亂時，輔助性T淋巴細胞等單核細胞分泌細胞因子，包括Ⅰ型干擾素、腫瘤壞死因子和白介素等，一起參與免疫功能的調節[15]。研究發現，可溶性PD-L1在肺癌患者血清中表達升高，且與肺癌分期、轉移和臨床結局密切相關，提示可溶性PD-L1分子能與腫瘤細胞膜上的PD-1分子相互作用參與免疫功能調節[16]。IFN-α作為Toll樣受體通路和干擾素刺激通路的最終產物，能夠反向調節T淋巴細胞，使活化的T淋巴細胞生存期延長，還能促進記憶性T淋巴細胞分化[17]。IFN-α還可誘導B淋巴細胞刺激因子產生，B淋巴細胞通過細胞受體與免疫球蛋白的結合而活化和分化，最終產生致病的自身抗體[18]。本研究發現，SLE患者PD-L1血清水平顯著下降，而IFN-α血清水平顯著升高，且PD-L1血清水平與IFN-α呈顯著負相關，提示持續活化的T淋巴細胞及單核細胞分泌IFN-α等細胞因子到血液，促進CD4+T細胞表面PD-L1表達，減少分泌到血清的PD-L1，共同參與免疫耐受，與以上文獻報道一致。本文還發現，PD-L1與SLE患者SLEDAI、抗dsDN抗體滴度和CRP呈負相關，與補體C3和C4呈顯著正相關，提示淋巴細胞表面表達和分泌的PD-L1和IFN-α與SLE 的病情活動性有關。

綜上，SLE患者淋巴細胞表面和血清PD-1/PD-L1分子表達異常與血清IFN-α和疾病活動度呈負相關。說明PD-1/PD-L1和IFN-α等細胞因子形成相互作用的調控網絡，共同參與SLE患者免疫功能調節。本文僅為臨床實驗室數據及淋巴細胞表面和可溶性血清細胞因子的檢測及相關性分析，具體機制有待進一步研究。