白樺脂醇對人胃癌MGC-803細胞增殖的抑制作用和凋亡誘導作用①

張 玉 李延玲 李書印 李 進 (南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院全科醫學，南陽 473058)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。我國是胃癌高發國家，其發病率和死亡率分別占全世界的42.6%和45%。對于處于早期的胃癌，手術切除能取得較好的治療效果。但胃癌起病隱匿，早期癥狀和體征不明顯，導致多數患者初次診斷時已經處于晚期。晚期胃癌多已發生肝臟、腹膜、周圍臟器和淋巴遠端轉移，難以實施手術治療。化療治療處于轉移期胃癌的主要作用是改善患者生活質量和延長生存期，且具有較大的毒副作用。曲妥珠單抗和貝伐單抗等靶向藥價格昂貴且臨床應用需綜合考量，因此尋找高效低毒且來源廣泛的治療藥物具有重要意義。近年來白樺樹皮的藥理作用受到廣泛關注，其提取物具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、降脂、利膽保肝等作用[1]。白樺脂醇是白樺皮中提取的羽扇烷型三萜類化合物，是白樺樹皮提取物中重要的活性成分。白樺脂醇對人體無毒，具有抗菌、抗病毒、神經保護、消炎、抗過敏等藥理學作用[2,3]。大量研究顯示，白樺脂醇對多種類型的癌癥具有抑制作用，如人乳腺癌、肺癌、胰腺癌等[4-6]。但白樺脂醇對人胃癌MGC-803細胞增殖和凋亡的影響尚未見報道。本文以體外培養的人胃癌MGC-803細胞為研究對象，探討白樺脂醇對MGC-803細胞增殖和凋亡的影響，為白樺脂醇抑癌的后續研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1材料 白樺脂醇(純度>98%，CAS：473-98-3)購自南京春秋生物；人胃癌MGC-803細胞株購自美國ATCC公司；細胞計數試劑盒(CCK-8)(貨號：YS-SO-000869)購自日本同仁研究所；DMEM高糖培養基(貨號：11965-092)和胎牛血清(貨號：12662-029)購自美國Gibco公司；胰酶和青霉素-鏈霉素雙抗購自美國Hyclone公司；抗體Ki67(貨號：ab16667)、增殖細胞核抗原(proliferating，PCNA)(貨號：ab18197)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinae，PI3K)(貨號：32089)、p-AKT(貨號：ab38449)、Bax(貨號：ab32503)、Cleaved caspase-9(貨號：ab2324)、Cleaved caspase-3(貨號：ab13847)、Bcl-2(貨號：ab32124)、p65(貨號：ab16502)、mTOR(貨號：32028)、Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒(貨號：abs50001A)購自北京賽寶克公司；磷酸化蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)(貨號：ab8805)、GAPDH抗體(貨號：ab8245)購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人胃癌細胞MGC-803接種于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，培養條件為37℃、5% CO2的飽和濕度培養箱。單層細胞覆蓋率達80%左右時傳代，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2藥物毒性實驗 將細胞分為：對照組、白樺脂醇低劑量組(10 μmol/L)、白樺脂醇中劑量組(20 μmol/L)和白樺脂醇高劑量組(50 μmol/L)，取對數生長期的MGC-803細胞，調整細胞密度至1×105個/ml接種于96孔板(100 μl/孔)。37℃、5%CO2培養4 h后，向對應孔中補充10 μl不同濃度的白樺脂醇，每組設置3個復孔，設置空白對照組(不加細胞懸液和藥物)，繼續培養24 h。向細胞中添加10 μl CCK-8溶液，繼續培養2 h，酶標儀檢測其490 nm處吸光值。細胞存活率=(OD藥物-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.2.3細胞計數試劑盒檢測細胞增殖 細胞分組同1.2.2，取對數生長期的MGC-803細胞，調整細胞密度至5×104個/ml接種于96孔板(100 μl/孔)，37℃、5%CO2培養4 h后，向對應的孔中補充10 μl不同濃度的白樺脂醇，每組設置3個復孔，設置空白對照組(不加細胞懸液和藥物)，繼續培養24、48、72、96 h。向細胞中添加10 μl CCK-8溶液，繼續培養2 h，酶標儀檢測450 nm處吸光值。

1.2.4Western blot檢測蛋白表達 MGC-803細胞培養于6孔板，當覆蓋率達90%左右時，換含不同濃度白樺脂醇的培養基繼續培養48 h，收集細胞，PBS清洗2次，加含蛋白酶抑制劑的裂解液，置于冰上30 min使細胞充分裂解。4℃下15 000 r/min離心20 min，取上清，BCA法測蛋白濃度。加蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min后，每孔上樣30 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品。轉移至PVDF膜，5%BSA室溫下封閉1 h；轉入稀釋后的一抗Ki67(1∶2 000)、PCNA(1∶2 000)、PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶ 2 000)、Bax(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)、Cleaved caspase-3(1∶2 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次；加二抗室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次；加ECL顯影液，成像系統中拍照。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡 取對數生長期的MGC-803細胞，于不同濃度白樺脂醇的培養基中培養24 h，1 500 r/min離心5 min收集細胞，用預冷的PBS清洗2次，加入200 μl Binding buffer重懸細胞，加入10 μl Annexin V于4℃避光條件下孵育30 min，加10 μl PI室溫避光孵育5 min后，上流式細胞儀檢測。采用Cellquest軟件進行分析，Anv+PI-為早期凋亡細胞，Anv+PI+為晚期凋亡細胞。

1.3統計學分析 所有實驗數據均采用統計學軟件SPSS18.0分析。兩組間比較使用t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1不同濃度白樺脂醇對MGC-803細胞存活的影響 當白樺脂醇的濃度低于50 μmol/L時，對MGC-803細胞活性無顯著影響；當白樺脂醇的濃度大于50 μmol/L時，MGC-803細胞活性降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 白樺脂醇分子式及不同濃度白樺脂醇對MGC-803細胞活性的影響

2.2白樺脂醇對MGC-803細胞增殖的影響 實驗結果如圖2所示，不同濃度白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細胞0～4 d后，細胞增殖倍數呈不同程度的降低，其作用效果具有白樺脂醇劑量性和時間依賴性。在第4天時，白樺脂醇各組細胞增殖倍數低于MGC-803組，差異有統計學意義(P<0.01)，表明白樺脂醇能夠抑制人胃癌MGC-803細胞增殖。

圖2 CCK-8檢測白樺脂醇對MGC-803細胞增殖的影響

2.3白樺脂醇對MGC-803細胞中Ki67和PCNA表達的影響 Western blot結果如圖3所示，MGC-803細胞經不同濃度的白樺脂醇處理48 h后，白樺脂醇低劑量組細胞中Ki67表達水平無明顯變化，PCNA表達水平降低(P<0.01)；白樺脂醇中、高劑量組Ki67和PCNA表達水平降低(P<0.01)，且降低作用呈白樺脂醇劑量依賴性，表明白樺脂醇能抑制人胃癌MGC-803細胞增殖標記蛋白Ki67和PCNA表達。

圖3 Western blot檢測白樺脂醇對增殖相關蛋白表達的影響

2.4白樺脂醇對MGC-803細胞凋亡的影響 流式細胞術結果顯示，不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細胞后，細胞凋亡比率顯著增加(P<0.01),且其作用具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖4。結果表明白樺脂醇誘導MGC-803細胞凋亡。

圖4 流式細胞術檢測白樺脂醇對MGC-803細胞凋亡的影響

2.5白樺脂醇對MGC-803細胞中凋亡相關蛋白表達的影響 不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細胞后，細胞中Bcl-2的表達水平降低，而Bax、Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達水平顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.01)，且其變化具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖5。

圖5 Western blot檢測白樺脂醇對MGC-803細胞中凋亡相關蛋白表達的影響

2.6白樺脂醇對PI3K/AKT通路相關蛋白表達水平的影響 不同濃度白樺脂醇處理胃癌細胞后，細胞中p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的比率降低，NF-κB p65和mTOR表達水平降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。上述變化具有白樺脂醇劑量依賴性，見圖6。

圖6 Western blot檢測PI3K/AKT通路相關蛋白的表達水平

3 討論

白樺脂醇是常見的三萜類化合物，可從白樺等植物中獲取。研究顯示，白樺脂醇及其衍生物可作為潛在的腫瘤治療藥物，對多種類型的腫瘤細胞具有抑制作用，如白樺脂醇能誘導多藥耐藥性的人腎癌細胞凋亡[7-9]。本文在此基礎上研究白樺脂醇對人胃癌MGC-803細胞增殖和凋亡的影響。采用藥物毒性實驗檢測不同濃度白樺脂醇對MGC-803細胞活性影響，根據實驗結果選擇濃度為10、20、50 μmol/L的白樺脂醇用于后續實驗。

無限增殖是惡性腫瘤細胞的重要特征之一。Li等[10]實驗發現白樺脂醇通過激活AMPK信號通路，抑制肺癌細胞增殖。Orchel等[11]研究顯示白樺脂醇及其衍生物能抑制黑色素瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，不同濃度白樺脂醇作用于人胃癌MGC-803細胞后，細胞增殖倍數顯著降低，Ki67和PCNA表達水平顯著降低。Ki67和PCNA表達水平與細胞增殖密切相關，是檢測腫瘤細胞增殖能力的可靠指標，提示白樺脂醇抑制人胃癌MGC-803細胞增殖。

在正常生理條件下，細胞增殖和細胞凋亡共同影響細胞數目，維持機體穩態。腫瘤細胞周期失常會導致腫瘤細胞快速增殖，且腫瘤細胞凋亡受到抑制，兩者共同造成腫瘤細胞無限增殖。Shtilman等[12]用白樺脂醇與金屬納米顆粒聯合處理正常細胞和黑色素瘤細胞，白樺脂醇對黑色素瘤的細胞毒性和細胞凋亡誘導作用呈劑量依賴性。本文研究顯示，不同濃度白樺脂醇處理MGC-803細胞后，細胞凋亡比率顯著增加，且其變化呈劑量依賴性。細胞凋亡通常由激活半胱氨酸蛋白酶caspase而誘發。Zhou等[13]研究發現，白樺脂醇能促進結直腸癌中NOXA蛋白表達，促進細胞色素C釋放，上調caspase-9和caspase-3表達，誘導結直腸癌細胞凋亡。本研究結果與之類似，白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細胞后，細胞中Bax、Cleaved caspase-9和Cleaved caspase-3表達水平顯著升高。當細胞色素C與Apaf-1和前體caspase-9結合，使細胞中活性氧含量顯著增加，線粒體膜電位降低，從而酶切caspase-9前體。活化的caspase-9又可通過酶切caspase-3前體使其活化。活化的caspase-3是細胞凋亡的關鍵執行者，能降解DNA復制相關蛋白、凋亡抑制蛋白及細胞骨架蛋白等，促使細胞凋亡不可逆地進行。Mihoub等[14]指出，白樺脂醇通過干擾線粒體呼吸鏈影響肺癌細胞生長和凋亡。白樺脂醇誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡。

PIK3/AKT通路參與細胞增殖、分化、凋亡及葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節。研究發現PI3K/AKT通路活性的增加與多種癌癥密切相關[15]。本研究結果顯示，不同濃度白樺脂醇作用于MGC-803細胞后，細胞中PI3K和p-AKT表達水平顯著降低。PI3K被激活后，通過一系列反應磷酸化激活AKT，AKT能促進凋亡抑制蛋白Bcl-2表達。Bax蛋白與Bcl-2結合形成復合體，能促進Bcl-2降解，解除Bcl-2對細胞凋亡的抑制作用。Bcl-2及Bax的表達調控細胞色素C的釋放，進而影響細胞凋亡[16,17]。Jing等[18]研究發現，白藜蘆醇通過PTEN調控PI3K/AKT信號通路，誘導MGC-803細胞周期阻滯。Tao等[19]的實驗也證實，抑制PI3K/AKT通路后，MGC-803細胞增殖受到抑制，而細胞凋亡增加。本研究表明，白樺脂醇抑制MGC-803細胞增殖，誘導細胞凋亡的作用機制可能與PI3K/AKT通路的抑制相關。

綜上，不同濃度白樺脂醇處理人胃癌MGC-803細胞后，細胞增殖倍數顯著降低，Ki67和PCNA表達水平顯著降低，發生凋亡的細胞比率顯著增加，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達水平顯著升高，提示白樺脂醇誘導人胃癌MGC-803細胞凋亡，抑制細胞增殖。但白樺脂醇對人胃癌MGC-803細胞增殖和凋亡產生影響的分子機制，以及動物實驗中能否產生相同的作用仍需進一步研究。