基于網絡藥理學分析白芍藥理作用機制

張生杰，龐文娟，王 麗

(武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000)

白芍為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛、養血調經、斂陰止汗等功效，臨床用于治療頭痛眩暈、脅痛、腹痛、四肢攣痛、血虛萎黃、月經不調、自汗、盜汗等[1]。相關研究發現其化學成分主要包括單萜及其苷類、三萜類、黃酮、鞣質、多糖、揮發油等物質，具有抗炎、鎮痛、抗菌、抗氧化、抗癌、抗抑郁和抗肝纖維化等作用；對自身免疫性疾病、心腦血管疾病和神經退行性疾病也能起到改善和治療作用[2]。現代藥理研究表明，白芍通過阻斷Toll樣受體4/5信號通路，抑制樹突狀細胞的功能，從而減輕了免疫介導的炎癥反應[3]，白芍主要成分芍藥總苷可通過下調E1B19k/Bcl-2結合蛋白Nip3基因表達，上調Kruppel型鋅指蛋白、紫外切除修復蛋白RAD23同族體B和熱休克蛋白1基因表達來抑制腫瘤[4]，通過阻斷TGF-β1/Smad信號轉導通路發揮抗肝纖維化作用[5]。不過盡管對白芍藥理學研究已有較多報道，但均未系統整體探討其成分、靶點、疾病、通路之間的相互聯系。

中藥具有多成分、多靶點、調節方式多樣的特點，蘊含了極大的信息量，采用西醫單靶標、單成分的研究思路來研究中藥，很難體現中藥的系統性[6]。自2007年HOPKINS[7]首次提出了網絡藥理學(network pharmacology)研究方法，該方法即廣泛應用于闡釋中藥藥理機制[8]、探究中藥的毒性機制[9]等，改變了傳統新藥研發“一個藥物、一個靶標、一種疾病”的理念。網絡藥理學在“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用的基礎上，通過網絡分析，以網絡靶點為切入點，從整體生物網絡穩定角度分析藥物分子與疾病網絡之間的關聯。本研究采用網絡藥理學技術分析白芍藥理作用機制，為其開發利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分篩選

采用中藥系統藥理數據庫(TCMSP)(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)分析平臺，以“白芍”為關鍵詞檢索其活性成分及靶點。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，化合物類藥性(drug-like，DL)≥0.18為篩選條件，再結合文獻挖掘與整理，依據化合物在單味藥中的含量、研究熱度等標準篩選出已報道的白芍活性成分[10]。

1.2 活性成分-靶點網絡的構建

將得到的白芍活性成分所對應的靶點通過UniProt數據庫(http：//www.uniprot.org/uploadlists/)翻譯成相應基因，所有靶點均為人源化。再將化合物及相應基因導入Cytoscape3.6.1軟件，繪制白芍活性成分-靶點網絡圖。在Cytoscape軟件網絡圖中，每個節點(node)是基因、蛋白或化合物，節點與節點之間的連接(edge)代表這些生物分子之間的相互關系，度值(degree)表示網絡圖中節點之間的連接數目，化合物度值越大，說明該化合物與多個靶點有關系，在疾病治療中起關鍵作用。

1.3 靶點-疾病網絡的構建

通過TCMSP平臺尋找與18個候選化合物相關的潛在靶點，并根據得出的靶點在TCMSP平臺中找出相關的疾病，導入Cytoscape3.6.1軟件，構建靶點-疾病相互作用網絡圖。用節點的大小和顏色表示degree值的大小，節點越大、顏色由黃到紅表示degree值越大；用粗細表示靶點與疾病之間的相互關系，邊越粗表示關系越緊密。

1.4 靶蛋白相互作用(PPI)

網絡的構建及hub基因篩選為明確白芍潛在靶蛋白之間的相互作用，將篩選得到的靶蛋白在STRING平臺(https：//string-db. org/)構建蛋靶白互作(PPI)網絡模型，將蛋白種類設置為“Homo sapiens(人類)”進行操作，最低相互作用閾值設為中等置信度 0.4“medium confidence”，其余參數保持默認設置。以PPI網絡連線的粗細代表相互的強弱，靶點的度值(Degree)表示相互作用的靶點個數。將PPI網絡模型導入Cytoscape3.6.1軟件，運用網絡分析CytoHubba插件篩選核心基因(hub gene)，采用最大集團中心性(Maximal clique centrality，MCC)的拓撲算法，核心基因對應的蛋白質即為具有重要生理調節功能的核心蛋白。

1.5 GO功能富集與KEGG信號通路分析

應用基因注釋及功能富集數據庫 DAVID 6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，對白芍潛在靶點進行基因本體論(Gene ontology，GO)功能富集分析，研究藥物靶點生物過程，在京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)進行信號通路富集分析，研究藥物靶點主要信號通路。

2 結果

2.1 白芍活性成分篩選

通過(TCMSP)篩選，得到白芍85個化合物分子中有14個符合條件，結合文獻挖掘與整理篩選出4個已報道的白芍活性成分丹皮酚[11]、熊果酸[12]、氧化芍藥苷[13]、沒食子酸甲酯[14]共計18個化合物作為候選化合物，見表1。

2.2 主要活性成分-靶點網絡

在TCMSP平臺檢索18個候選化合物的作用靶點，其中12個化合物檢索出146個相應靶點，6個化合物未檢索出對應靶點，以此構建白芍化合物-靶點網絡圖，包含106個節點、274條邊，其中12個紫色節點代表了白芍的活性成分，94個藍色節點代表了靶點，274條邊代表了化學成分與靶點的相互作用，通過活性成分-靶點網絡圖發現白芍中山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜在白芍藥理中發揮了重要作用，見圖 1。

表1 白芍活性成分篩選結果

圖1 白芍活性成分-靶點網絡

2.3 靶點-疾病相互作用網絡分析

潛在靶點與相關疾病構建的靶點-疾病相互作用的網絡圖，由246個節點，包括46個靶點節點、200個疾病節點和378條邊組成，94個靶點中有48個靶點在靶點-疾病網絡圖中沒有相對應的疾病，說明還存在尚未被發現的作用途徑。網絡圖中PTGS2(前列腺素G /H合酶2)的degree值最大，與32種疾病相關，包括炎癥、惡性腫瘤、痛癥、心血管疾病等，這與現代藥理實驗結論相吻合[15-16]。又如PPARG(過氧化物酶體增生激活受體γ)參與調節了21種不同的疾病，包括胰腺癌、胰腺癌、膀胱癌、動脈粥樣硬化、哮喘、炎癥、糖尿病、肥胖癥等。篩選出degree>3的17種疾病，乳腺癌(9)、非特異性癌癥(9)、哮喘(8)、慢性炎癥(8)、炎癥(6)、前列腺癌(6)、克羅恩氏病(5)、焦慮癥(5)、阿爾茨海默氏病(5)、心臟衰竭(4)、類風濕關節炎(4)、精神分裂癥(4)、胰腺癌(4)、膀胱癌(4)、糖尿病(4)、骨關節炎(4)、心肌梗塞(4)，由此可見，白芍在這些疾病的治療中發揮了一定作用，這與白芍抗炎、鎮痛、抗癌、抗抑郁的功效相吻合。見圖2。

圖2 白芍靶點與疾病相互作用網絡

2.4 靶蛋白互作網絡及hub基因篩選

將白芍94個靶點導入String數據庫，限定物種為“人”，構建蛋白相互作用關系，其中一些蛋白與其他蛋白沒有相互關系，將不再在相互關系網絡圖中體現，將數據導入Cytoscape軟件構建蛋白互作PPI網絡圖(圖3)。圖3中節點代表蛋白，邊表示蛋白之間的相互關系，共有87個節點、702條邊。用節點的大小和顏色表示degree值的大小，節點越大、顏色由紅到藍表示degree值越大，用邊的粗細表示蛋白之間的相互關系Combine-score，邊越粗表示Combine-score值越大，說明蛋白之間的關系越緊密。根據Cytoscape軟件Cytohubba插件，MCC算法計算前10個關鍵基因(AKT1、IL6、TNF、JUN、PTGS2、MAPK8、CASP3、MAPK1、ICAM1、VCAM1)，提示這些關鍵基因在白芍藥理機制中發揮關鍵作用。見圖4。

2.5 GO生物過程富集結果

對白芍94個靶基因進行GO生物過程富集，GO注釋分為三大類，分別是：分子生物學功能(Molecular function，MF)、生物學過程(Biological process，BP)和細胞學組分(Cellular components，CC)。通過這三個功能，對一個基因的功能進行多方面的限定和描述[17]，通過DAVID數據庫以人類基因為背景對白芍預測靶點GO進行生物過程富集分析(P<0.05)，圖5-圖7分別列出了顯著性較高的10種。從結果來看白芍活性成分作用的靶點主要富集在分子功能的正調節、細胞凋亡的調控、程序性細胞死亡的調控、細胞死亡的調控、細胞增殖調控等生物過程中，在細胞組成方面，細胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分占比較高；在分子功能方面，腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結合排在前列。

圖3 蛋白-蛋白相互作用網絡

圖4 蛋白-蛋白相互作用網絡中關鍵基因(hub)基因篩選

圖5 白芍活性成分靶點的BP富集分析(一)

圖6 白芍活性成分靶點的BP富集分析(二)

圖7 白芍活性成分靶點的BP富集分析(三)

2.6 KEGG信號通路富集結果

對白芍94個靶點進行KEGG信號通路富集，根據P<0.05篩選出前20條信號通路，分別為癌癥通路、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡、神經活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號通路、前列腺癌、肌萎縮側索硬化癥(ALS)、小細胞肺癌、II型糖尿病、T細胞受體信號通路、鈣信號通路、結直腸癌、細胞色素P450對外源物質代謝的影響、色氨酸代謝、神經營養素信號通路、脂肪細胞因子信號途徑、胰腺癌、B細胞受體信號通路、孕酮介導的卵母細胞成熟、藥物代謝信號通路(圖8)。白芍可以通過Toll樣受體信號通路、NOD樣受體信號通路、T細胞受體信號通路、B細胞受體信號通路等途徑發揮抗炎免疫調節的作用[18]，現已開發成上市藥物(白芍總苷膠囊)，常用于治療類風濕性關節炎[19]；也可以作用于癌癥的細胞凋亡、前列腺癌、小細胞肺癌、結直腸癌、胰腺癌等多條癌癥相關途徑以抑制腫瘤的生長，誘導癌細胞凋亡；通過細胞色素P450對外源物質代謝的影響[20]、藥物代謝信號通路發揮保肝功效。表明白芍的活性成分可以作用于這些信號通路發揮藥理作用。

圖8 白芍靶點的KEGG通路

3 討論

白芍作為理氣止痛、疏肝解郁良藥，有明顯的抗炎、鎮痛、抗抑郁功效，但作用機制尚不明確。網絡藥理學分析與中醫藥整體觀的思想基本一致，利用網絡藥理學的方法有助于闡釋白芍物質基礎與作用機制。本研究檢索出白芍84個化學成分，通過條件篩選選出12個化合物作為白芍主要活性成分，且大多數都符合Lipinski五規則[21]，化合物-靶點網絡圖顯示了白藥多成分、多靶點相互作用的特點，其主要通過山柰酚、兒茶素、丹皮酚、芍藥苷、芍藥苷元、芍藥二酮、β-谷甾醇、谷甾醇、沒食子酸甲酯、齊墩果酸、反亞油酸甲酯、丁子香萜發揮藥理作用。

藥物靶點被視為藥物在機體內的作用結合位點，包括基因位點、受體、酶、離子通道、核酸等生物大分子等，選擇確定新穎的有效藥物靶點在新藥研發中具有重要意義[22]。對白芍靶點-疾病相互作用網絡分析發現PTGS2、PPARG、TNF、HSP90AB1、ALOX5、CYP1A2等是白芍抗炎、疼痛、抗抑郁、抗腫瘤的關鍵靶點，同時也發現TNF、ADRB2、PDE3A、PPARG、CYP1A2、SELE、ALOX5多個靶點對哮喘有明確的相互作用，但目前并沒有與此相關的文獻報道，提示可以開展與其作用機制相關的研究，并將其運用到臨床哮喘的治療，此外靶點PPARG、PTGS2、SELE、ALOX5對銀屑病具有靶向作用，TNF、HTR2A、PPARGV、DPP4、INSR對糖尿病具有靶向作用，這對研究開發白芍新的適應證具有指導意義。

通過對白芍作用蛋白的相互作用分析，白芍靶蛋白之間是一個相互交錯的網絡關系，并非單獨發揮作用。其中AKT1、PTGS2、TNF、JUN、VCAM1、CASP3、ICAM1、IL-6、MAPK8、MAPK1是治療疾病的核心靶點，白芍發揮藥理作用離不開這些關鍵靶蛋白的直接或者間接作用，如AKT1編碼的AKT蛋白細胞生長信號通路中的傳感器，在生長因子或胰島素介導的信號轉導中扮演重要的角色，在營養代謝、細胞生長、轉錄調控和細胞存活中也具有重要作用[23]。ICAM1和VCAM1都是免疫球蛋白超家族成員，在炎癥性細胞因子作用下，其通常在內皮細胞和免疫系統細胞上表達，會導致炎癥分子的集中，從而產生炎癥，ICAM1在調解細胞與細胞間的炎癥反應中起重要作用[24-25]。PTGS2可將花生四烯酸轉化為前列腺素H2，PTGS2上調與細胞黏附增加、表型變化、細胞凋亡和腫瘤血管生成有關，具有抗炎抗氧化作用[26]，從而揭示白芍抗炎作用機制。此外，TNF是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一[27]，Caspases-3在細胞凋亡中具有不可替代的作用，IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖，分化并提高其功能對研究白芍抗腫瘤、提高免疫力具有重要的指導意義。

GO富集分析和KEGG通路注釋分析結果表明，白芍主要活性成分靶點主要通過分子功能正調節、細胞凋亡的調控、程序性細胞死亡的調控、細胞死亡的調控、細胞增殖調控在細胞分子、不溶性組分、微粒體、泡狀部分、膜組分上發生腎上腺素受體活性、胺受體活性、α腎上腺素能受體活性、藥物結合等分子反應。從KEGG信號通路富集來看，白芍主要涉及癌癥的途徑、Toll樣受體信號通路、細胞凋亡、神經活性配體-受體相互作用、NOD樣受體信號通路、前列腺癌、肌萎縮側索硬化癥、小細胞肺癌、Ⅱ型糖尿病、T細胞受體信號通路等反應，白芍主要通過這些信號通路發揮抗炎、鎮痛、抗腫瘤、保肝作用。此外白芍可以作用于肌萎縮側索硬化癥(ALS)、色氨酸代謝信號途徑，為開發治療肌肉萎縮新藥提供了途徑[28]。相關實驗也證明了這些信號通路的存在，在人臍靜脈內皮細胞中，芍藥苷能夠抑制溶血卵磷脂誘導的炎性因子的產生，這種抑制作用與高遷移率族蛋白B1-晚期糖基化終產物/Toll樣受體2 /Toll樣受體4-NF-κB信號通路有關[29]。

綜上所述，基于網絡藥理學技術研究白芍物質基礎和藥理作用機制，符合中藥多成分、多靶點、調節方式多樣性的特點，上述預測靶點與已知文獻報道的藥理作用相吻合，說明了預測靶點的準確性。不過現有文獻多集中在白藥抗炎機制的研究，對抗腫瘤、提高機體免疫力方面的報道較少，今后需加強在這些方面的研究，為白芍的開發利用提供新的思路。