miR-33a-5p靶向SMAD7對血管平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移及細胞外基質降解的影響①

朱彥彬 李 立 王賢芝 仲 偉 張富釗

(川北醫學院附屬醫院血管外科,南充 637000)

心血管疾病是世界人口死亡的主要原因，主要包括冠狀動脈疾病、中風、動脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死和中風等[1]。研究表明血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)異常增殖是動脈粥樣硬化等心血管疾病發生發展的重要因素[2]。在病理條件下，生長調節因子、細胞因子和血管活性物質的異常升高能夠促進血管平滑肌細胞的增殖，并改變血管平滑肌細胞的基因表達[3]。其中，血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是最有效的誘導血管平滑肌細胞增殖和遷移的因子之一[4]。miRNA表達異常與心血管疾病密切相關，是靶向治療心血管疾病的新路徑。已有眾多文獻報道miR-33有助于調節高密度脂蛋白膽固醇的動態平衡，提示其或許能夠成為心血管疾病和新陳代謝疾病的潛在靶標，但其對血管平滑肌細胞增殖、凋亡及細胞外基質降解的影響并不清楚[5]。SMAD7過表達能夠促進細胞增殖，其在血管平滑肌細胞增殖中具有重要作用[6，7]。本文主要探究miR-33a-5p靶向SMAD7對血管平滑肌細胞增殖、凋亡、遷移及細胞外基質降解的影響，為心血管疾病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 DMEM培養基購自上海慧穎生物(貨號：C11960500BT)，胎牛血清購自素爾生物(貨號：16000-044)，miR-33a-5p mimic和SMAD7質粒購自上海生物工程，Trizol試劑(貨號：kp800-101)購自寧波有成生物醫藥科技有限公司，BCA試劑盒(貨號：ZY80815)購自上海澤葉生物科技有限公司，Dual Luciferase報告基因試劑盒(貨號：GM-040502A)購自上海翊圣生物科技有限公司，CCK-8試劑盒(貨號：CK0115-01)購自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.1.2細胞 血管平滑肌細胞購自中國上海科學院細胞庫，于含10% 胎牛血清的DMEM培養基中，在37℃、5%CO2的培養箱中培養。

1.2方法

1.2.1轉染及PDGF-bb處理 根據Lipofectamine 2000說明書將miR-33a-5p mimic和SMAD7質粒分別或者聯合轉染至血管平滑肌細胞。PDGF-bb處理濃度為10～30 ng/ml，分別于24、48和72 h用CCK-8法測定增殖。

1.2.2RT-PCR 將細胞收集后用Trizol試劑提取總RNA，進行定量分析并調平后，用反轉錄試劑盒合成cDNA。以GAPDH為內參進行RT-PCR檢測。GAPDH上游引物序列：5′-ATGGGGAAGGT-GAAGGTCG-3′，下游引物序列：5′-TTACTCCTTGGAGGCCATGTG-3′；miR-33上游引物序列：5′-CCAGCTGGGGTGCATTGTAGT-3′，下游引物序列：5′-GGGAGCAGAATTAATACGACTCACTATAGC-3′；SMAD7上游引物序列：5′-CAACTGCAGACTGTCC-AGATG-3′，SMAD7下游引物序列:5′-CTGCTGCATAAACTCGTGGTC-3′。

1.2.3靶基因預測 運用基因預測軟件：miRanda(http://www.microna.org/microrna/home.do)、Tar Base(http://diana.calab.ece.ntua.gr/tarbase)、TargetScan(http:// www.targetscan.org) 和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)，預測miR-33a-5p的靶基因。

1.2.4雙熒光素酶報告實驗 以海腎熒光素酶的熒光值作為內參，按照Dual Luciferase報告基因試劑盒說明書進行。

1.2.5CCK-8檢測細胞增殖能力 在96孔板中配制100 μl的細胞懸液，將培養板在37℃、5%CO2培養箱培養，分別以24、48和72 h為檢測點，在450 nm處檢測。每次檢測前每孔加CCK-8溶液10 μl，繼續孵育1 h，終止培養。

1.2.6Western blot 用RIPA裂解液提取各組血管平滑肌細胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，然后經 SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉膜儀轉移蛋白質至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入一抗在4℃封閉過夜，然后加入對應二抗室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光。

1.2.7流式細胞術檢測細胞凋亡 加入適量胰酶細胞消化液消化細胞，離心棄上清，收集細胞，加入195 μl Annexin V-FITC結合液輕輕重懸細胞，再加入5 μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。離心棄上清，加入 190 μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞，加入10 μl 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，采用流式細胞儀檢測。

1.2.8劃痕實驗檢測細胞遷移 將細胞消化鋪滿單層后用小號槍頭垂直劃痕，加入無血清培養基，在5%CO2、37℃恒溫培養箱中培養24 h后，顯微鏡下拍照，用 Image J 軟件分析。

2 結果

2.1PDGF-bb處理對VSMCs細胞增殖和miR-33表達的影響 PDGF-bb對VSMCs的增殖具有時間依賴性和濃度依賴性，且在30 ng/ml和72 h差異具有統計學意義(P<0.01，圖1A、B)。qRT-PCR檢測發現PDGF-bb處理顯著抑制miR-33在VSMCs細胞中的表達，差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01，圖1C、D)。

圖1 PDGF-bb對VSMCs細胞增殖和miR-33a-5p表達的影響Fig.1 Effect of PDGF-bb on cell proliferation and miR-33a-5p expression in VSMCsNote:A.Effect of different treatment time of PDGF-bb on proliferation of VSMCs cells was detected by CCK-8;B.Effect of different concentrations of PDGF-bb on proliferation of VSMCs cells was detected by CCK-8;C.Effect of different treatment time of PDGF-bb on expression of miR-33a-5p in VSMCs cells was detected by qRT-PCR;D.Effect of different concentrations of PDGF-bb on expression of miR-33a-5p in VSMCs cells was detected by qRT-PCR.*.P<0.05，**.P<0.01 versus control group.

2.2miR-33a-5p直接靶向SMAD7 由基因預測軟件篩選出SMDA7作為miR-33a-5p的靶基因，miR-33a-5p與SMAD7在3′UTR區存在結合位點(圖2A)； 熒光素酶報告基因實驗結果表明：miR-33a-5p與野生型SMAD7熒光素酶活性明顯降低(P<0.01，圖2B)，與突變型沒有明顯變化，說明miR-33a-5p直接靶向作用于SMAD7。

圖2 miR-33a-5p靶向作用于SMAD7Fig.2 miR-33a-5p targets to SMAD7Note:A.Target genes of miR-33a-5p were screened by gene prediction software miRanda，TargetScan and Pubmed;B.Targeting relationship was detected by luciferase activity;**.P<0.01 versus control group.

2.3miR-33a-5p過表達對miR-33和SMAD7 mRNA表達的影響 qRT-PCR檢測結果顯示：與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞miR-33明顯上調、SMAD7 mRNA表達明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3A)；SMAD7組VSMCs細胞miR-33明顯下調、SMAD7 mRNA表達明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3A)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞miR-33表達比miR-33a-5p mimic組明顯下調、比SMAD7組明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3A)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞SMAD7表達比miR-33a-5p mimic組明顯上調、比SMAD7組明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3A)。

通過Western blot檢測SMD7蛋白表達水平發現：與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞SMAD7蛋白表達明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3B)，SMAD7組VSMCs細胞SMAD7蛋白表達明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3B)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞SMAD7表達比miR-33a-5p mimic組明顯上調、比SMAD7組明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖3B)。

圖3 miR-33a-5p和SMD7表達水平Fig.3 miR-33a-5p and SMD7 expression levelsNote:A.Expression levels of miR-33a-5p and SMD7 mRNA were detected by qRT-PCR;B.Expression level of SMD7 protein was detected by Western blot;**.P<0.01 versus control group;##.P<0.01 versus single transfection group.

2.4miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs細胞增殖 與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞增殖明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4A)，SMAD7組VSMCs細胞增殖明顯增強，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4A)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞增殖比miR-33a-5p mimic組明顯增強、比SMAD7組明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4A)。

與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞增殖標記蛋白PCNA和Ki67明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4B)，SMAD7組VSMCs細胞增殖標記蛋白PCNA和Ki67明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4B)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達比miR-33a-5p mimic組明顯上調、比SMAD7組明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖4B)。

圖4 各組細胞增殖情況Fig.4 Cell proliferation in each groupNote:A.Proliferation of each group was detected by CCK-8;B.Expression levels of PCNA and Ki67 were detected by Western blot;**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.5miR-33a-5p靶向SMAD7誘導VSMCs細胞凋亡 與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞凋亡明顯增強，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5A)，SMAD7組VSMCs細胞凋亡明顯減弱，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5A)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞凋亡比miR-33a-5p mimic組明顯減弱、比SMAD7組明顯增強，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5A)。

與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞凋亡標記蛋白Caspase-3和Caspase-9明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5B)，SMAD7組VSMCs細胞凋亡標記蛋白Caspase-3和Caspase-9明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5B)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞凋亡標記蛋白Caspase-3和Caspase-9表達比miR-33a-5p mimic組明顯下調、比SMAD7組明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖5B)。

圖5 各組細胞凋亡情況Fig.5 Apoptosis of each groupNote:A.Apoptosis of each group was detected by flow cytometry;B.Expression levels of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by Western blot;**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.6miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs細胞遷移 與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞傷口愈合率明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01，圖6)，SMAD7組VSMCs細胞傷口愈合率明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01，圖6)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞傷口愈合率比miR-33a-5p mimic組明顯升高、比SMAD7組明顯降低，差異具有統計學意義(P<0.01，圖6)。

圖6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力(×400)Fig.6 Migration ability of each group was tested by scratch test(×400)Note:**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

2.7miR-33a-5p靶向SMAD7抑制VSMCs細胞外基質降解 與對照組相比，miR-33a-5p mimic組VSMCs細胞MMP-2和MMP-9明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖7)，SMAD7組VSMCs細胞MMP-2和MMP-9明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖7)；mimic+SMAD7 組VSMCs細胞MMP-2和MMP-9表達比miR-33a-5p mimic組明顯上調，比SMAD7組明顯下調，差異具有統計學意義(P<0.01，圖7)。

圖7 Western blot檢測MMP-2和MMP-9的表達水平Fig.7 Expression levels of MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotNote:**.P<0.01 vs control group;##.P<0.01 vs single transfection group.

3 討論

血管平滑肌細胞異常增殖已被證明能加速血管疾病的發展，了解血管平滑肌細胞異常增殖的分子機制對確定新的心血管疾病治療靶點至關重要。PDGF-bb主要由血管內皮細胞和血小板在血管損傷部位釋放，已有研究顯示PDGF-bb能夠通過調節轉錄因子和關鍵分子信號通路促進血管平滑肌細胞增殖和遷移[8]。PDGF-bb處理對血管平滑肌細胞中miRNA的表達具有不同的調控作用，即可使miR-15b、miR-541、miR-146b-5p等miRNA表達上調，也能抑制miR-599、miR-21、miR-145等miRNA的表達[9-11]。本研究結果表明：PDGF-bb處理能夠增強血管平滑肌細胞細胞增殖，抑制miR-33的表達。大量研究表明，miRNA參與細胞發育、生長、分化、增殖和凋亡等多種細胞過程[12]。通過與靶基因的3′UTR結合來調節基因表達，并導致蛋白質翻譯抑制，從而發揮作用[13]。本文通過研究發現：miR-33a-5p與SMAD7在3′UTR區存在結合位點，miR-33a-5p直接靶向作用于SMAD7，且miR-33a-5p過表達會抑制SMAD7的表達。

miRNA靶向調控在血管平滑肌細胞增殖中發揮重要作用，如miR-145通過靶向CD40對血管平滑肌細胞增殖有抑制作用[14]。本研究發現：miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb誘導的血管平滑肌細胞增殖，并下調增殖標記蛋白PCNA和Ki67表達。miRNA靶向調控在血管平滑肌細胞凋亡中也具有重要作用，如Shen等[15]研究發現miR-29b靶向MMP-2促進平滑肌細胞凋亡。本研究流式和Western blot檢測發現，miR-33a-5p靶向SMAD7促進PDGF-bb誘導的血管平滑肌細胞凋亡，上調凋亡標記蛋白Caspase-3和Caspase-9的表達。miRNA靶向調控在血管平滑肌細胞遷移中也具有重要作用，如miR-503通過靶向胰島素受體抑制PDGF-bb誘導的人主動脈血管平滑肌細胞增殖和遷移[16]。本研究通過劃痕實驗發現，miR-33a-5p靶向SMAD7能夠降低PDGF-bb誘導的血管平滑肌細胞傷口愈合率，抑制血管平滑肌細胞遷移。

血管平滑肌細胞的增殖和遷移常伴有細胞外基質的降解與重構的快速轉換，而MMPs是細胞外基質的降解與重構的關鍵酶。MMPs是一個依賴Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子的內肽酶家族，其在細胞外基質的降解和調節細胞與細胞黏連、細胞遷移和浸潤、細胞增殖與凋亡、組織重塑等生理活動中發揮著重要作用[17]。MMP-2主要作用是降解細胞外基質的基底膜，Park等[18]研究發現MMP-2上調增加血管平滑肌細胞基質的降解，并促進血管平滑肌細胞的遷移；MMP-9主要功能是降解和重塑細胞外基質的動態平衡，Aesim等[19]報道MMP-9是調節平滑肌細胞增殖和遷移所必需的；Mason等[20]研究表明MMP-9過表達增加血管平滑肌細胞基質的降解，并增強血管平滑肌細胞遷移。因此，MMP-2和MMP-9的上調會促進平滑肌細胞外基質的降解，增強細胞的遷移。本研究發現，miR-33a-5p靶向SMAD7抑制血管平滑肌細胞MMP-2和MMP-9 的表達，說明miR-33a-5p能夠靶向SMAD7抑制PDGF-bb誘導的血管平滑肌細胞外基質的降解。

綜上所述，本研究初步證明PDGF-bb處理可增強血管平滑肌細胞細胞增殖，抑制miR-33表達。miR-33a-5p靶向SMAD7抑制PDGF-bb誘導的血管平滑肌細胞增殖、遷移和細胞外基質的降解，并促進凋亡。miR-33a-5p有望成為新的心血管疾病治療靶點，這為心血管疾病的預防和治療奠定實驗基礎。