大口黑鱸北方亞種、佛羅里達(dá)亞種及“優(yōu)鱸3號”雜交F1子代生長性能及遺傳多樣性分析

王佩佩，周國勤，陳樹橋，陸 健

（南京市水產(chǎn)科學(xué)研究所，南京 210036）

大口黑鱸（Micropterussalmoides）又名加州鱸，屬于鱸形目（Perciformes），太陽魚科（Centrarchide），黑鱸屬，原產(chǎn)于北美地區(qū)，屬廣溫性魚類，在水溫2～34℃、鹽度0～15時均可存活，其肉質(zhì)鮮嫩、營養(yǎng)豐富、抗病力強(qiáng)、生長迅速，有“淡水黃魚”的美稱，已被引進(jìn)到世界其他各地作為游釣品種或水產(chǎn)養(yǎng)殖品種［1］。20世紀(jì)70年代末我國臺灣省從國外引進(jìn)大口黑鱸，并于1983年人工繁殖獲得成功，同年從臺灣省引入廣東省進(jìn)行人工養(yǎng)殖。大口黑鱸養(yǎng)殖近40年來，產(chǎn)業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，深受養(yǎng)殖者和消費(fèi)者的歡迎，已成為我國重要淡水養(yǎng)殖品種之一，現(xiàn)階段大口黑鱸養(yǎng)殖年產(chǎn)量超過45萬t［2］，且每年以一定的規(guī)模擴(kuò)增。然而，大口黑鱸自引種以來再未有新的種質(zhì)資源應(yīng)用于實際生產(chǎn)養(yǎng)殖，在經(jīng)過PAPD、AFLP、微衛(wèi)星［3－5］等方法對國內(nèi)養(yǎng)殖的大口黑鱸群體進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，遺傳多樣性已經(jīng)顯著降低，優(yōu)良性狀發(fā)生退化［6－7］。因此，亟需選育出兼具生長性能好、抗逆性強(qiáng)的大口黑鱸新品種系。

微衛(wèi)星DNA（microsatellite DNA）是一種在真核生物基因組中廣泛分布的短串聯(lián)重復(fù)DNA序列，是動植物遺傳及育種研究較常用的一種分子標(biāo)記，微衛(wèi)星具有種類多、分布廣、多態(tài)信息含量高、操作容易、易于擴(kuò)增等優(yōu)點［8－9］，已在水產(chǎn)動物輔助育種、種質(zhì)資源鑒定、遺傳結(jié)構(gòu)分析等方面廣泛應(yīng)用。雜交育種能夠?qū)⒂H本的優(yōu)良性狀轉(zhuǎn)移給子代，是獲得具有優(yōu)良經(jīng)濟(jì)性狀養(yǎng)殖品種的有效途徑之一。

最初引種進(jìn)入國內(nèi)的大口黑鱸品種為北方亞種，后又引入佛羅里達(dá)亞種，北方亞種具有生長快的特點，佛羅里達(dá)亞種耐高溫、抗病力強(qiáng)，而大口黑鱸新品種“優(yōu)鱸3號”為人工培育的能攝食配合飼料的新品種，可利用這3個種系的優(yōu)點培養(yǎng)具有雜交優(yōu)勢的新品系。本研究利用“優(yōu)鱸3號”、佛羅里達(dá)亞種及北方亞種作為親本來源進(jìn)行選育，對雜交子代同塘養(yǎng)殖生長性狀進(jìn)行統(tǒng)計分析，同時結(jié)合微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)分析群體間的遺傳多樣性來篩選優(yōu)良組合，以期為大口黑鱸優(yōu)良品種的培育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用親魚來源于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所良種基地自繁自育的“優(yōu)鱸3號”、佛羅里達(dá)亞種及北方亞種，選取其中體質(zhì)健壯、個體大、體色好、無損傷、無病害的個體［體質(zhì)量（598±104.45）g］作為繁育親本。

1.2 實驗方法

1.2.1 人工繁育

2018年4月初，對“優(yōu)鱸3號”、佛羅里達(dá)亞種及北方亞種3個種群在相同時間內(nèi)進(jìn)行人工繁育，共設(shè)計3種雜交組合方式，分別為“優(yōu)鱸3號”♀（T）×北方亞種♂（N）、“優(yōu)鱸3號”♀（T）×佛羅里達(dá)亞種♂（S）、佛羅里達(dá)亞種♀（S）×北方亞種♂（N），3種雜交群體分別用TN、TS、SN表示，每種雜交組合選取親魚100尾（雌雄各50尾）1∶1進(jìn)行配對，待親魚性腺發(fā)育逐步成熟后用地歐酮和HCG進(jìn)行激素注射，使之能夠同步產(chǎn)卵。雌魚用量為地歐酮5 mg·kg－1，HCG 1 000單位·kg－1，兩者混合制成注射液進(jìn)行注射，雄魚注射量減半。產(chǎn)卵孵化后，對魚苗進(jìn)行常規(guī)培育。培育過程中保持各組魚苗的生活環(huán)境基本相同。

1.2.2 生長對比

為比較各雜交組合子代在外部生長環(huán)境相同情況下生長上的優(yōu)劣，在魚苗生長達(dá)到3.5月齡后用1mm金屬絲（CWT）對尾部、背部及胸部進(jìn)行標(biāo)記，各組合的標(biāo)記部位如表1所示，每種雜交組合子代個體各標(biāo)記1 000尾，標(biāo)記后在同一池塘中進(jìn)行同塘養(yǎng)殖，餌料來源為粗蛋白含量48%的膨化飼料，每隔一段時間從池塘中隨機(jī)取樣，每個群體取120尾（雌雄各60尾），對其體質(zhì)量（精確到0.01 g）進(jìn)行測量。

表1 不同雜交組合金屬絲標(biāo)記部位Tab.1 CWT marker sites of different hybrid combinations

1.2.3 DNA提取

從每個組合子代中剪取32個個體的尾鰭樣本，采用上海捷瑞生物工程有限公司的細(xì)胞／組織基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行DNA提取，提取的基因組DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量和濃度，剔除未提取出來或濃度較低的DNA并重新提取，留取可用DNA樣品保存于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 微衛(wèi)星引物篩選及PCR擴(kuò)增

從已開發(fā)的大口黑鱸微衛(wèi)星引物中挑選出9個能穩(wěn)定擴(kuò)增的位點用于群體分析［10］。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物位點詳細(xì)信息見表2。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μL）：滅菌水（7.4μL）、2×TaqMix（10μL）、10μmol·L－1正反引物（各0.8μL）、模板DNA（1μL）。PCR熒光擴(kuò)增反應(yīng)體系（10μL）：滅菌水（5.79μL）、2×TaqMix（2.85μL）、10μmol·L－1正引物（0.04 μL）、10μmol·L－1反引物和熒光引物（各0.16 μL），50 ng·μL－1模板DNA（1μL）。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，32個循環(huán)，其中每個循環(huán)包括94℃變性30 s，退火溫度30 s（各個位點退火溫度詳見表2），72℃延伸30 s，最后72℃延伸5 min，4℃保存。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，在凝膠成像儀中觀察是否擴(kuò)增出目的片段且成單一條帶，若有單一條帶，則上樣于ABI 3500 xl基因分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測熒光信號并利用軟件GeneMarker 1.97分析微衛(wèi)星位點的片段長度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運(yùn)用Popgene32（Version 1.31）分析各個群體在9個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)（A）、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、Nei氏遺傳距離（Ds）、遺傳相似度、遺傳分化指數(shù)（Fst）和基因流（Nm）；用PIC CALC軟件計算多態(tài)信息含量（PIC）。根據(jù)群體間的Nei氏遺傳距離，用Mega 5.0軟件進(jìn)行UPGMA聚類分析，以分析雜交群體之間的親緣關(guān)系。體標(biāo)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0進(jìn)行分析，在單因子方差分析的基礎(chǔ)上采用Duncan’s多重比較檢驗組間差異，以P＜0.05作為差異顯著。

大口黑鱸F1子代絕對增長率（AGR）、相對增長率（RGR）的計算公式如下：

絕對增長率：AGR＝（W2－W1）／（t2－t1）

相對增長率：RGR＝（W2－W1）／W1（t2－t1）

式中，W1和W2分別表示幼魚在不同月齡的體質(zhì)量（g），t1和t2分別表示兩個不同的月齡。

2 結(jié)果與分析

2.1 體質(zhì)量分析

分別對大口黑鱸3個雜交組合F1子代在2月齡、3.5月齡、5月齡、6月齡和7月齡共5個月齡的體質(zhì)量進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)顯示，3個組合子代的平均體質(zhì)量在不同月齡呈現(xiàn)不同程度的顯著性差異（P＜0.05）（表3），根據(jù)平均數(shù)可知，TS組合在5個月齡的平均體質(zhì)量均高于其他兩個組合，其次為TN。

2.2 絕對增長率和相對增長率

在絕對增長率方面，TS組合在2～3.5月齡、3.5～5月齡、5～6月齡、2～7月齡4個月齡段顯著高于其他兩個組合（P＜0.05），其次為TN。各組合的相對增長率在各月齡沒有顯著差異（P＞0.05）（表4）。

2.3 微衛(wèi)星分析

TN、TS、SN 3個群體的遺傳參數(shù)信息見表5（包括各個位點在3個群體中的等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量）。3個群體的平均多態(tài)信息含量分別為0.511、0.521、0.382 3，其中TS群體的多態(tài)信息含量最高；觀測雜合度分別為0.604 2、0.559 0、0.472 2；期望雜合度分別為0.573 4、0.600 3、0.454 2。各基因座的基因流（表6）平均為2.470 9（1＜基因流＜4），遺傳分化指數(shù)平均值為0.091 9，存在一定程度的遺傳分化，其中JZL12位點的遺傳分化較大（基因流＜1），JZL85、JZL23、JZL31 3個位點的遺傳分化較?。ɑ蛄鳎?）。用Popgene32計算3個群體的Nei氏遺傳距離與遺傳相似度（表7），數(shù)據(jù)顯示，TS群體和TN群體的遺傳相似度最高（0.912 6），TN群體和SN群體的遺傳相似度最低（0.776 1）。聚類分析顯示TS群體和TN群體先聚為一支，再與SN群體聚為一支。

表2 大口黑鱸9對微衛(wèi)星引物序列及特征Tab.2 Primer sequences and characteristics of ninem icrosatellites of M icropterus salmoides

表3 不同生長時期體質(zhì)量的平均值及多重比較Tab.3 Average value and multiple comparisons of body weight at different grow th stages （g）

表4 3種組合的絕對增長率和相對增長率Tab.4 Absolute and relative grow th rates of three combinations

表5 9個微衛(wèi)星位點在3個群體中的遺傳參數(shù)Tab.5 Genetic parameters of ninem icrosatellite loci in three populations

表6 3個群體在9個微衛(wèi)星位點上的遺傳分化系數(shù)（F st）與基因流（N m）Tab.6 Genetic differentiation coefficient（F st）and gene flow（N m）at ninem icrosatellite loci in three populations

表7 大口黑鱸3個雜交組合Nei氏遺傳距離與遺傳相似度Tab.7 Genetic distance and genetic sim ilarity of Nei in three hybrid com binations of M icropterus salmoides

圖1 3個群體聚類分析Fig.1 Cluster analysis of three populations

3 討論

雜交育種是指不同品種、品系間以及不同種屬間、亞科間的個體通過雜交，獲得在生長性能及遺傳多樣性等方面優(yōu)于雙親的新品種［11］，通過雜交可以有效地增加群體遺傳結(jié)構(gòu)變異和遺傳分化，提高群體的遺傳多樣性，也可以將雙親的優(yōu)良性狀最大程度地集中到后代中［12］，從而改善后代的生長性狀，獲得人們預(yù)期的優(yōu)良新品種（系），因此雜交育種已經(jīng)成為改善魚種品質(zhì)的重要手段之一［13］。微衛(wèi)星DNA用于群體標(biāo)記時主要檢測指標(biāo)有等位基因數(shù)、觀測雜合度、期望雜合度、PIC值等、遺傳分化指數(shù)等，一個群體的等位基因數(shù)越大，PIC值就越大：當(dāng)PIC＞0.5時，該基因位點為高度多態(tài)位點；0.25＜PIC＜0.5時，為中度多態(tài)位點；PIC＜0.25時，為低度多態(tài)位點［14］?？刂撇煌誀畹幕蜃辉截S富，該群體的遺傳多樣性就越高，所含優(yōu)良性狀的概率更大，對環(huán)境變化所產(chǎn)生的適應(yīng)能力就越強(qiáng)，更適合作為選育的基礎(chǔ)群體，本研究將“優(yōu)鱸3號”、佛羅里達(dá)亞種、北方亞種3個群體的大口黑鱸作為基礎(chǔ)群體，培育出3個雜交子代群體，采用9對微衛(wèi)星引物對3個子代群體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)TS組合的平均等位基因數(shù)、平均PIC值、平均期望雜合度等都高于其他兩個組合，且PIC值為0.521，表現(xiàn)為高度多態(tài)（PIC＞0.5），這表明TS組合具有更大的選育空間和開發(fā)潛力。遺傳雜合度的大小直接反映了群體遺傳變異的高低［15］，雜合度越高，遺傳變異越高，群體適應(yīng)環(huán)境的能力越強(qiáng)，本研究中3個群體的平均觀測雜合度和期望雜合度都相對較高，說明3個群體的遺傳多樣性都相對較高，可以用作選育的基礎(chǔ)群體。3個群體在9個微衛(wèi)星位點的遺傳分化系數(shù)為0.091 9，表示有9.19%的遺傳分化來自于3個不同的組合之間，說明這3個組合有一定程度的遺傳分化，具有潛在的選育潛能?，F(xiàn)有的大口黑鱸引進(jìn)原種主要分為兩個亞種，一種是分布在美國中東部、墨西哥東北部和加拿大東南部的大口黑鱸北方亞種［16］，另一種是分布在佛羅里達(dá)州南部的大口黑鱸佛羅里達(dá)亞種［17］。2010年，大口黑鱸“優(yōu)鱸1號”（簡稱“優(yōu)鱸1號”）通過國家水產(chǎn)新品種審定，成為世界上第一個大口黑鱸選育新品種［18］。大口黑鱸最新品種“優(yōu)鱸3號”是以之前通過審定的新品種“優(yōu)鱸1號”和從美國新引進(jìn)的大口黑鱸北方亞種為基礎(chǔ)選育種群，采用群體選育技術(shù)與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的育種方法，以攝食人工配合飼料條件下的生長性狀和易馴化攝食配合飼料為主要選育指標(biāo)，經(jīng)連續(xù)4代選育而獲得，其相對于普通大口黑鱸生長優(yōu)勢更加明顯［19］，本研究中，將“優(yōu)鱸3號”群體分別和佛羅里達(dá)亞種、北方亞種進(jìn)行雜交，結(jié)果顯示“優(yōu)鱸3號”♀（T）×佛羅里達(dá)亞種♂（S）（TS）在生長性能方面更優(yōu)于“優(yōu)鱸3號”♀（T）×北方亞種♂（N）（TN），3個群體生長性能大小依次是TS＞TN＞SN。在對我國引進(jìn)大口黑鱸分類地位研究中，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所采用兩對微衛(wèi)星引物分別對原產(chǎn)地北方亞種、原產(chǎn)地佛羅里達(dá)亞種、我國養(yǎng)殖的大口黑鱸群體進(jìn)行微衛(wèi)星對比，發(fā)現(xiàn)我國養(yǎng)殖的大口黑鱸屬于北方亞種［20］，由此可知“優(yōu)鱸3號”也屬于經(jīng)過選育的北方亞種，在本研究中，“優(yōu)鱸3號”♀（T）×佛羅里達(dá)亞種♂（S）（TS）生長性能優(yōu)于“優(yōu)鱸3號”♀（T）×北方亞種♂（N）（TN）和佛羅里達(dá)亞種♀（S）×北方亞種♂（N）（SN），體現(xiàn)出了亞種間的雜交優(yōu)勢，說明對具有不同優(yōu)勢的亞種進(jìn)行雜交是提高大口黑鱸生產(chǎn)性能及遺傳多樣性的一個有效途徑，能更進(jìn)一步提升雜交后代的品質(zhì)。綜上所述，在本研究中，“優(yōu)鱸3號”♀（T）×佛羅里達(dá)亞種♂（S）（TS）雜交組合，在一定程度上提升了雜交后代的遺傳多樣性和生長性能，其雜交組合更優(yōu)。本研究結(jié)果可為大口黑鱸進(jìn)一步的品種培育和遺傳改良提供科學(xué)依據(jù)，為大口黑鱸的產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的良種支撐。