飼料中β 胡蘿卜素添加量對脊尾白蝦生長及抗氧化酶活性的影響

王 玉，柳 森，段健誠，王林華，鄧高威，張慶起，閻斌倫，2，4，高 煥，2，4

（1.江蘇海洋大學海洋科學與水產學院，江蘇省海洋生物技術重點實驗室，連云港 222005；2.江蘇省海洋資源開發研究院，連云港 222005；3.連云港贛榆佳信水產開發有限公司，連云港 222100；4.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺，南京 210014）

脊尾白蝦（Exopalaemoncarinicauda）是我國水產養殖的重要品種之一［1］。在山東、江蘇、浙江等沿海地區脊尾白蝦的養殖面積已達2萬hm2，年產量超過4.5萬t［2］。但隨著養殖分布和產量的不斷擴大，脊尾白蝦的種質退化非常明顯，色質、存活率、抗氧化能力均有顯著的下降［3］。因此開發新型飼料、改善脊尾白蝦的色澤、促進脊尾白蝦生長等對脊尾白蝦養殖業的發展有重要作用。

研究表明類胡蘿卜素對水產動物有重要影響，如改善水產動物體色和肉質、提高水產動物繁殖力、促進生長、提高抗氧化能力等［4］。而水產動物本身不能合成類胡蘿卜素，只能從食物中獲取［5］，所以類胡蘿卜素作為一種飼料添加劑在水產配合飼料中應用廣泛。作為類胡蘿卜素中最為重要的具有維生素A活性的一種，β 胡蘿卜素對提升水產動物的生理功能有廣泛作用［5］，例如飼料中添加β 胡蘿卜素可提高錦鯉（Cyprinuscarpio haematopterus）的色質、中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）的繁殖力和孵化率、鮭魚屬魚類（Oncorhynchus）和鱒屬魚類（Salmo）的卵子質量、斑馬魚（Daniorerio）的抗氧化能力［6－9］。

本文擬使用不同劑量的β 胡蘿卜素飼喂脊尾白蝦仔蝦，探究飼料中β 胡蘿卜素的添加量對脊尾白蝦的生長和抗氧化酶活性的影響，以期獲得脊尾白蝦飼料中β 胡蘿卜素的最佳添加量，為脊尾白蝦人工養殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脊尾白蝦仔蝦（0.29±0.01）g由江蘇連云港贛榆佳信水產開發有限公司提供。β 胡蘿卜素添加劑（β 胡蘿卜素含量1%）購自武漢秉德生物科技有限公司。超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化氫酶（CAT）的測定所用試劑盒由南京建成生物工程研究所生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

選取大小均勻、體格健壯、活動力強的脊尾白蝦仔蝦450尾，隨機分成5組，每組設置3個重復，每個重復30尾，放入提前配備好海水的60 L（50 cm×40 cm×30 cm）小型硬塑料水箱內（箱中注水體積為箱容積的三分之二），β 胡蘿卜素添加劑按0 g·kg－1（A組，對照）、0.5 g·kg－1（B組）、1.0 g·kg－1（C組）、1.5 g·kg－1（D組）、2.0 g·kg－1（E組）濃度加入基礎飼料中投喂，脊尾白蝦基礎飼料的配置方案和成分含量參見表1。

1.2.2 實驗飼料制備

根據表1配方，分別將各組原料混合均勻，超細粉碎，加入一定量的清水攪拌，再用絞肉機擠壓出2 mm的顆粒，緊接著將擠壓出的飼料放入60℃烘箱中3 h，再用攪拌機將飼料粒打碎，用篩絹網篩選出0.2～0.8 mm的飼料顆粒，置于－4℃冰箱保存備用。

表1 實驗飼料配方和營養水平Tab.1 Test feed formula and nutritional level

1.2.3 飼養管理

養殖期間，自然光照，全天24 h充氧，溶氧量＞5mg·L－1，鹽度為23.0±0.1，pH為7.8±0.2，水溫為16.0～20.0℃。實驗開始前將脊尾白蝦仔蝦饑餓24 h，以達到清理蝦腸道的目的。飼喂時間為早晚各喂一次，分別為早晨8∶00和下午6∶00，投喂量為初始脊尾白蝦體質量的3%，實際投喂量根據脊尾白蝦的生長狀況和吃食情況進行適當的增減。投喂前每天進行清污，同時觀察蝦的生活狀態，如果發現死蝦，及時撈出，并做好記錄。投喂飼料后0.5 h，對蝦的進食情況進行觀察，蝦的頭部如果出現灰色小點說明蝦進食完成，根據情況吸出殘餌，防止蝦過度進食。在早晨投喂1 h以后進行換水，換水量為水體積的1／3，2 d換一次，換水前備好已配鹽度并經曝氣的海水。每天觀察增氧機運行情況，防止蝦因缺氧造成死亡。飼養周期為30 d。

1.3 樣本采集與制備

飼養結束后，饑餓脊尾白蝦24 h，將各個分組的存活蝦全部撈出，分別裝入袋子中，標好分組號，然后用紙巾吸掉體表的水分，測定各組實驗蝦總質量，取平均值得各組蝦終末質量。用手術解剖刀片去殼、取肉、切碎，用電子天平準確稱取0.2 g待測機體的肌肉組織，按質量（g）∶體積（mL）＝1∶9的比重，用移液槍加入9倍體積的生理鹽水，在冰水浴中用機械勻漿器勻漿，每次勻漿10 s，間隔休息30 s，勻漿3～5次，于冷凍離心機中5 000 r·min－1離心10 min，取上清液按1∶9的比例用生理鹽水稀釋成1%組織勻漿，放入冰箱中－20℃保存待測，并于24 h內測完酶活，酶活測定方法嚴格按照說明書進行。

1.4 指標測定

存活率（SR）、特定生長率（SGR）、質量增加率（WGR）具體計算公式如下：

存活率（%）＝st／s0×100%

特定生長率（%·d－1）＝（lnwt－lnw0）／t×100%

質量增加率（%）＝（wt－w0）／w0×100%式中，wt是實驗結束時脊尾白蝦的平均體質量（g），w0是實驗初始脊尾白蝦的平均體質量（g），st是實驗結束時脊尾白蝦存活數量（尾），s0為實驗初始投放脊尾白蝦數量（尾），t為實驗周期（d）。

1.5 數據處理方法

所有測得的數據均采用平均值±標準差（Mean±SD）表示。利用SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析，并采用LSD法進行多重比較分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的影響

添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長有顯著的影響，顯著性檢驗結果見表2，其中脊尾白蝦的特定生長率（SGR）、質量增加率（WGR）、存活率（SR）在濃度0.5～1.5 g·kg－1范圍內顯著高于對照組（P＜0.05），β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1、1.0 g·kg－1、1.5 g·kg－1時，SGR分別增加11.94%、6.29%、10.69%，WGR分別增加89.88%、65.24%、80.94%，SR分 別 增 加83.35%、50.01%、60.01%，均顯著高于對照組（P＜0.05）。但添加濃度達到2.0g·kg－1時，與對照組相比，SGR不再增加，SR則有下降的趨勢，下降幅度達16.65%。比較各添加濃度組，β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1時β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的效果最佳，SGR、WGR、SR增加幅度達到最高（11.94%、89.88%、83.35%），并明顯高于對照組（P＜0.05）。

表2 飼料中β 胡蘿卜素添加量對脊尾白蝦生長的影響（平均值±標準差）Tab.2 Effect ofβ carotene addition in feed on grow th performance of Exopalaemon carinicauda（M ean±SD）

2.2 添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

通過測定脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶（SOD）、酸性磷酸酶（ACP）、堿性磷酸酶（AKP）和過氧化氫酶（CAT）活性，表明β 胡蘿卜素的添加量對脊尾白蝦抗氧化酶活性有顯著的影響（表3）。β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內，脊尾白蝦的抗氧化能力均有一定程度的提升。β 胡蘿卜素添加量在0.5 g·kg－1、1.0 g·kg－1、1.5 g·kg－1時，相對于對照組，SOD分別增加10.41%、33.04%、18.81%，ACP分別增加46.50%、38.09%、57.76%，CAT分別增加148.82%、105.29%、102.94%；其中SOD在β 胡蘿卜素添加量1.0 g·kg－1時最高，達到60.84 U·mgprot－1，ACP在β 胡蘿卜素添加量1.5 g·kg－1時最高，達到66.97 U·mg－1，CAT在β 胡蘿卜素添加量0.5 g·kg－1時最高，達到4.23 U·mgprot－1；而AKP分 別 下 降41.04%、12.74%、37.74%。β 胡蘿卜素的添加量達到2.0 g·kg－1時，脊尾白蝦的抗氧化能力并沒有提升，SOD、ACP和CAT與對照組無明顯差異（P＞0.05），相反AKP出現了顯著增加，相比對照組提高了35.61%。

3 討論

3.1 β 胡蘿卜素對脊尾白蝦生長的影響

本研究通過測定脊尾白蝦的特定生長率、質量增加率、存活率，發現一定濃度的β 胡蘿卜素對脊尾白蝦的生長有顯著促進效果，其中添加量在0.5 g·kg－1時，特定生長率、質量增加率、存活率分別提高了11.94%、89.88%、83.35%，揭示了β 胡蘿卜素作為水產動物飼料添加劑的可行性。β 胡蘿卜素對水產動物生長影響的研究已有多次報道，例如楊新瑜和劉貴軍［10］以4%的β 胡蘿卜素添加在飼料中投喂89尾均重128 g的中華鱉（Trionyxsinensis）73 d，結果發現，添加β 胡蘿卜素的試驗組成活率比對照組提高了13.5%，日增重提高了105.6%。袁春營和崔青曼［7］以添加50、100 mg·kg－1β 胡蘿卜素的飼料飼喂中華絨螯蟹（Eriocheirsinensis）60 d，結果發現，中華絨螯蟹的存活率都達到了100%，質量增加率比對照組分別提高了13.08%、26.23%。白東清等［11］以添加1.0g·kg－1β 胡蘿卜素（1%）的飼料飼喂錦鯉（Cyprinuscarpiohaematopterus）2個月，結果發現，錦鯉的增長率達到370.2%，顯著高于對照組。這些研究結果說明飼料中適當添加β 胡蘿卜素確實能促進水產動物生長。但是，本文研究也發現當β 胡蘿卜素（1%）添加量達到2.0 g·kg－1時，脊尾白蝦的存活率與對照組相比下降了16.65%。盡管較高劑量β 胡蘿卜素導致脊尾白蝦死亡的機制不明，但是不能否認β 胡蘿卜素對脊尾白蝦的積極調節效果。本實驗規格（0.29±0.01）g的脊尾白蝦飼料中β 胡蘿卜素（1%）添加量為0.5 g·kg－1時，發現脊尾白蝦生長效果最好，因此在水產養殖過程中探明脊尾白蝦生長對β 胡蘿卜素添加濃度的響應范圍后，β 胡蘿卜素可以作為養殖脊尾白蝦的一種飼料添加劑。

3.2 飼料中添加β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

本研究對脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性測定表明，β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化性有顯著影響，且依賴于β 胡蘿卜素的添加濃度。一般認為超氧化物歧化酶通過歧化反應把動物機體中有害的超氧自由基轉化成過氧化氫（H2O2）［12－13］，再通過過氧化氫酶將過氧化氫轉化成水，從而完成對機體的保護防御［14－15］。當β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內時，發現脊尾白蝦的抗氧化能力有一定程度的提升，韓繼衛等［16］以β 胡蘿卜素飼喂三角帆蚌（Hyriopsiscumingii）時，發現隨著β 胡蘿卜素濃度的升高，SOD與CAT酶的活力先升高后降低，本文的結果與其相似。其他水產動物如仿刺參（Apostichopusjaponicus）的抗氧化能力隨飼料中β 胡蘿卜素含量（30～60 mg·kg－1）的增加而差異不明顯，但添加達到90 mg·kg－1時SOD、CAT酶 活 性 出 現 下 降［17］；脂 鯉（Hyphessobrycon caltistus）攝食添加類胡蘿卜素的飼料后血清中的總抗氧化能力出現升高，SOD活力則降低［18］；中華絨螯蟹攝食添加適量β 胡蘿卜素飼料后體內SOD活性降低［7］，本文結果與其有所差異，但這些研究都表明β 胡蘿卜素與水產動物的抗氧化能力有一定的關聯性。

表3 飼料中β 胡蘿卜素添加量對脊尾白蝦抗氧化酶的影響（平均值±標準差）Tab.3 Effect ofβ carotene addition in feed on antioxidant enzymes in Exopalaemon carinicauda（M ean±SD）

酸性磷酸酶和堿性磷酸酶是甲殼類動物體內不可或缺的非特異性免疫酶，其免疫機制是直接參與磷酸基團的化學反應，降解生物機體體表的磷酸類物質［19－20］，這種免疫機制是造成細胞活性氧的來源之一［21］。本研究發現添加β 胡蘿卜素后各添加組酸性磷酸酶活性出現了一定程度的增加。張坤［22］研究發現飼料中添加含β 胡蘿卜素含量高的膠紅酵母可以顯著提高刺參（Oplopanaxelatus）的酸性磷酸酶活性，馮任勇和周小秋［23］研究也發現維生素A（β 胡蘿卜是一種維生素A源）提高了建鯉（C.carpiovar.jian）的酸性磷酸酶活性。在測定堿性磷酸酶活性時，本文發現β 胡蘿卜素的添加量在0.5～1.5 g·kg－1范圍內堿性磷酸酶活性出現下降，與酸性磷酸酶的結果相反。何海琪和孫鳳［24］對中國明對蝦（Penaeuschinensis）的研究表明對蝦的堿性磷酸酶在肌肉中幾乎測不出活性，而在肝胰臟中活性很高，并認為堿性磷酸酶具有組織特異性，因此盡管筆者測定發現添加一定范圍劑量β 胡蘿卜素的脊尾白蝦肌肉堿性磷酸酶活性出現下降，但不能認為脊尾白蝦免疫能力的下降。

另外，本研究通過分析β 胡蘿卜素對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響，發現除堿性磷酸性酶外，其他幾個酶活性相對于對照組來說都有增強，但變化幅度與β 胡蘿卜素的添加濃度不一致，與生長情況也不一致，表明β 胡蘿卜素對脊尾白蝦肌肉組織中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶活性及脊尾白蝦生長情況的影響在0.5～1.5 g·kg－1范圍內是非線性的。這種不一致現象在三角帆蚌［16］、仿刺參［17］、建鯉［23］的研究中也被發現。因此本研究認為β 胡蘿卜素對水產動物非特異性免疫能力的增強既依賴于β 胡蘿卜素的濃度，也依賴于具體的生物種類。