盆痛靈灌腸對子宮內膜異位癥模型大鼠疼痛行為的影響及其機理探討

付金榮，朱姍，徐英，沈宇鳳，溫歡歡，吳詩瑋

(1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院婦科，上海 200032； 2.開封市第二中醫院，河南 開封 475004)

子宮內膜異位癥(Endometriosis，EMs)是婦科常見疾病，超過10%的育齡婦女出現慢性盆腔疼痛、痛經和不孕，嚴重影響婦女的健康和生活質量，且內異癥疼痛形態多樣，反復發作，成為婦科臨床的難治之癥。筆者認為EMs病因可歸結為“濕”“熱”“瘀”并存，互為因果，日久纏綿發為慢性盆腔疼痛，采用清熱利濕、活血止痛的盆痛靈方治療，取得滿意療效[1]，本課題通過建立SD大鼠EMs模型，采用盆痛靈直腸給藥觀察大鼠疼痛行為學的變化及其可能的作用機理，現將結果報道如下。

1 材料

1.1 動物

SPF級9周齡雌性SD大鼠，體質量為(180±20)g，合格證號：SCXK(滬)2014-0016。動物購自北京維通利華實驗動物有限公司，均飼養于上海中醫藥大學動物實驗中心，飼養室溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照時間12 h，可自由飲食。動物實驗嚴格遵守上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會的要求。

1.2 藥物

(1)盆痛靈水煎劑：由三棱、莪術、延胡索、川楝子和虎杖組成，水煎劑由上海中醫藥大學附屬龍華醫院提供，臨用前稀釋，按照成人每日用藥的20倍擴大，即按20.4 g/(kg·d)配成水煎劑，該劑量即為臨床等效量。低、中、高劑量組給藥劑量分別為10.2 g/(kg·d)、20.4 g/(kg·d)、40.8 g/(kg·d)；(2)消炎痛混懸液(規格：0.1 g，湖北東信藥業有限公司，批準文號：國藥準字H42021462)成人每日用量25 mg，臨用前按3 mg/(kg·d)配制成混懸液。

1.3 實驗主要試劑和儀器

異氟烷(湖北一品制藥股份有限公司)；TNF alpha試劑盒(批號：BMS622、BMS622TWO、BMS622TEN；廠家：Thermo Fisher)；Rat beta-NGF試劑盒(批號：ELR-bNGF；廠家：RayBiotech)；IL-1β試劑盒(批號：BMS630；廠家：Thermo Fisher)。Von Frey 2390 型機械性測痛儀(意大利UGO BASILE公司)；YP-100型嬰兒培養箱(日本ALOKA公司)；酶標儀(型號：MK3；廠家：THERMO)；恒溫孵育箱(型號：DNP9082；廠家：精宏)；離心機(型號：L-500；廠家：湘儀)；微量震蕩器(型號：MM-1；廠家：金壇市醫療器械廠)。

2 實驗方法

2.1 造模、分組、給藥方法

參照Berkley[2]方法行大鼠自身種植內膜,造模成功異位內膜有積液形成突起，觀察病灶的大小、形態。假手術組大鼠不行內膜種植，而是在開腹后將右側子宮結扎，將結扎段子宮剪掉，后關腹。兩周后與造模組一起常規開腹和關腹。

采用完全隨機設計方法，將60只SD雌性大鼠隨機抽取10只作為假手術組，其余作為EMs動物模型，分組及給藥方法如下：(1)假手術組，每日以2 mL 0.9%NaCl溶液灌腸；(2)模型組，每日以2 mL 0.9%NaCl溶液灌腸；(3)盆痛靈高劑量組，每日以40.8 g/kg灌腸；(4)盆痛靈中劑量組，每日以20.4 g/kg劑量灌腸；(5)盆痛靈低劑量組，每日以10.2 g/kg劑量灌腸；(6)消炎痛組，每日3 mg/kg消炎痛混懸液灌腸。

2.2 檢測方法

2.2.1 內異灶體積的測量

測量異位灶的最大橫徑，和與之垂直的縱徑，測量器械為游標卡尺。

2.2.2 機械痛閾的測量

保持環境的安靜,后將大鼠放置于自制的透明塑料箱里,大鼠適應環境30 min,待其安靜后開始進行測定。采用vonFrey2390型機械性電子測痛儀進行測量,探針沿鐵絲網邊緣逐漸刺向大鼠后爪腳掌正中,后勻速施加壓力，當大鼠出現縮腿或逃跑行為時記錄儀器屏幕上顯示的壓力值(精確度0.1 g),此壓力值即為機械痛閾值(PWT)。

2.2.3 Elisa實驗方法

給藥4周后，將大鼠麻醉后腹主動脈取血約5 mL，離心后取上清放入-80 ℃冰箱保存待測，生理鹽水沖洗腹腔，并吸取腹腔液約2 mL同放入-80 ℃冰箱保存待測。在標準品孔、待測樣本孔加樣50 μL，Blank加100 μL樣本稀釋液，每孔加人生物素標記抗體50 μL，覆上板貼，室溫孵育2 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次，甩干后每孔加入100 μL酶聯親和素,覆上板貼，室溫溫育1 h。棄去孔內液體，甩干，洗板3次，甩干后依序每孔加底物溶液100 μL，室溫避光顯色10 min。后依序每孔加終止溶液100 μL，終止反應。在反應終止后用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度(OD值)。

2.3 檢測指標

給藥4周，觀察：(1)機械痛閾值：采用von Frey 2390型機械性電子測痛儀進行測量機械痛閾值(PWT)，每只大鼠重復測定3次,每次測量間隔均等，然后取平均值[3]。(2)內異病灶體積：計算公式V=1/2a×b2(a為最大橫徑，b為與之垂直的縱徑)。(3)各組大鼠腹腔液及血清中NGF、IL-1β和TNF-α的濃度。

2.4 統計學方法

使用Excel進行數據的錄入與管理，數據統計采用SPSS21.0，計量資料如果滿足正態性和方差齊性，采用重復測量方差分析、單因素方差分析，若符合正態但不符合方差齊，用校正的配對t檢驗；若不滿足正態性采用秩和檢驗。所有檢驗均采用雙側檢驗，以P≤0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 模型組大鼠手術前后機械痛閾值的變化

術前，模型組與假手術組大鼠機械痛閾值比較無明顯差異(P=0.801>0.05)。假手術組大鼠術前與術后機械痛閾值比較無統計學差異(P=0.647>0.05)，即手術操作對SD大鼠的機械痛閾值并無影響。模型組大鼠術后機械痛閾值呈下降趨勢，且與時間成負相關，時間越長，大鼠機械痛閾值越低，可能與內異灶的形成有關，也進一步說明造模是成功的。(見圖1)。

圖1 假手術組及模型組大鼠機械痛閾值的比較

3.2 內異灶體積的大小與機械痛閾值的相關性分析

與給藥前相比，盆痛靈高、中、低劑量各組大鼠內異灶體積均有所縮小(P<0.05)，其中以盆痛靈高、中劑量組內異灶體積縮小明顯(P<0.05)。低劑量組與西藥組大鼠內異灶體積給藥前后均無明顯差異(P>0.05)，模型組不予藥物治療，內異灶體積反而增大(P<0.05)，因此模型組大鼠機械痛閾值隨著時間延長呈明顯下降趨勢，即大鼠機械痛閾值與內異癥體積呈負相關，體積越大，痛閾值越低(見表1，圖2)。

表1 給藥前后各組大鼠內異灶體積大小的比較

圖2 給藥前后大鼠內異病灶體積(mm3)的變化

3.3 中藥盆痛靈對EMS模型大鼠機械痛閾值的干預作用

給藥前，即手術后1周，各組大鼠機械痛閾值比較無明顯差異(P=0.347>0.05)，給藥4周后，假手術組和模型組痛閾值無明顯差異(P>0.05)。盆痛靈高、中、低劑量組、西藥組痛閾值較給藥前均有升高(P<0.05)，盆痛靈高劑量組機械痛閾值升高最為明顯，其次為盆痛靈中劑量組，盆痛靈低劑量組的痛閾值與西藥組無顯著差異(P>0.05)，但明顯高于假手術組和模型組(見表2，圖3)。

表2 各組給藥前后大鼠痛閾值的比較

圖3 各組給藥4周大鼠機械痛閾值比較

3.4 各組大鼠腹腔液及血清中NGF、IL-1β和TNF-α的濃度影響

在血清和腹腔液中，與假手術組比較，模型組的NGF、IL-1β和TNF-α濃度均升高(P<0.01),提示IL-1β、NGF和TNF-α可能參與EMs的發病過程。與模型組比較，西藥和盆痛靈高、中劑量組血清及腹腔液中IL-1β、NGF和TNF-α水平均降低(P<0.01)，盆痛靈低劑量組血清中IL-1β降低(P<0.05)。提示西藥和盆痛靈方可能通過降低IL-1β、NGF和TNF-α濃度起到抗EMs的作用。盆痛靈各劑量組比較結果顯示，與低劑量組比較，中劑量組血清中的IL-1β、NGF表達降低(P<0.05，P<0.01)，高劑量組血清IL-1β、NGF和TNF-α濃度降低(P<0.01)，高中劑量組腹腔液中IL-1β、NGF和TNF-α濃度均降低(P<0.01)。與中劑量組比較，高劑量組血清中NGF和TNF-α表達降低(P<0.05)，高劑量組腹腔液中IL-1β和NGF表達降低(P<0.05，P<0.01)(見表3，表4)。

表3 各組大鼠血清中NGF、IL-1β和TNF-α表達

表4 各組大鼠腹腔液中NGF、IL-1β和TNF-α表達

4 討論

子宮內膜異位癥(EMs)是一種雌激素依賴性的炎性疾病，病因復雜，病程反復，其發病率約占育齡婦女的10%，痛經及非周期性骨盆疼痛等疼痛癥狀最為常見[4]。痛經漸進性加重對患病婦女的身心健康和生活質量有著嚴重影響[5]。

盆痛靈灌腸方由三棱、莪術、虎杖、延胡索和川楝子組成，功效活血化瘀，清熱利濕。方中三棱、莪術為君，兩者均能破血祛瘀，行氣止痛。虎杖善降泄肝膽濕熱，為清熱利濕之良藥，又可活血祛瘀，逐散濕熱、瘀血之邪，方中再佐以延胡索、川楝子活血理氣止痛，使瘀阻胞宮沖任之瘀血、濕濁、濕熱之邪有去路，血液循經而行，沖任氣機順暢，經行通暢，“通則不痛”。由于慢性盆腔痛病位在盆腔，經直腸給藥可直接通過腸壁滲透藥液，直接改善盆腔微環境，使藥力直達病所，亦可減少長期服用苦寒藥物對胃的刺激。前期研究表明采用盆痛靈直腸給藥治療EMs所致的慢性盆腔疼痛患者療效顯著[6]。

有研究認為，EMs致痛機制與疾病本身的病因一樣復雜，炎癥反應、雌激素、神經纖維損傷再生、中樞神經系統異常等均有可能成為致痛因素[7]。本課題通過大鼠EMs模型模擬人類EMs的臨床癥狀，實驗中當機械性壓力增大時大鼠出現后肢收縮與臨床上很多痛經患者檢查時拒按腹部或者出現腹肌緊張狀態，癥狀類似。因此本課題主要選用大鼠的機械痛閾值作為造模成功與否和藥物鎮痛療效的疼痛行為學評價標準。大鼠造模后機械痛閾值明顯降低，且隨著時間延長，大鼠內異病灶體積逐漸增大，而大鼠的機械痛閾值呈現逐漸下降趨勢，與內異灶的浸潤、生長有關，同理，EMs病灶浸潤越深患者盆腔疼痛感越強烈，同時也可能與病灶粘連程度相關，粘連程度越高，疼痛越強烈[8]。對EMs模型大鼠二次開腹時發現盆腔粘連，亦證實此觀點。然假手術組造模前后機械痛閾值無顯著性差異，說明手術或者結扎大鼠子宮造成的炎癥并不會影響大鼠的痛閾值。盆痛靈方及消炎痛片直腸給藥后EMs模型大鼠的機械痛閾值呈上升趨勢，隨著治療時間增加，大鼠機械痛閾值上升越明顯，且盆痛靈方高劑量組鎮痛效果最優，而盆痛靈方低劑量組與消炎痛組上升程度相當，說明盆痛靈方鎮痛作用與時間、濃度呈正比，且低劑量盆痛靈方的鎮痛作用與消炎痛片相當。

眾所周知內異癥疼痛的痛覺是一種內臟痛，疼痛沖動是經過副交感神經(盆神經)傳到脊髓的，在脊髓背角換元，其軸突可在同側或對側脊髓前外側索上行，達丘腦，然后投射到大腦皮質。可認為異位的子宮內膜作為一種傷害性刺激引起種植部位的外周組織釋放和生成多化學和細胞因子，可能參與激活和調制傷害性感受器。目前認為可能與局部前列腺素增高、炎性因子異常以及異位病灶機械性牽拉等有關，但其明確的發病機制至今仍然不清。

有研究發現，EMs 患者不同類型的異位病灶均有NGF 的高表達，且與患者疼痛癥狀的嚴重程度密切相關[9]。NGF導致疼痛可能存在外周機制：可能與釋放PGs及相關炎癥因子有關，NGF促炎癥因子釋放作用主要通過肥大細胞實現，NGF可誘導肥大細胞脫顆粒，釋放大量組胺、肝素、腫瘤壞死因子、蛋白酶、IL、5羥色胺等炎癥介質致敏傷害性感受器，繼而導致疼痛[10]。同時肥大細胞也可釋放NGF[11]，使炎癥信號進一步放大。NGF 可以被炎癥性細胞因子正調解，致炎因子IL-1β和TNF-α 能刺激NGF 的表達。另一方面，內異癥患者腹腔液中IL1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子含量增高，浸潤神經可分泌P物質、降鈣素基因相關蛋白、氨基丁酸、神經肽、5羥色胺等致痛物質，其中P物質、CGRP 和神經肽可以調節疼痛的中樞傳導過程[12]。因此可以假定，內異灶中的NGF及其受體含量增高通過外周及中樞機制引發EMs疼痛。

本研究表明異位內膜種植后，EMs大鼠內異灶周圍的腹腔液中NGF和炎癥因子IL-1β、TNF-α濃度均升高，同時發現 EMs大鼠血清中NGF和炎癥因子IL-1β、TNF-α濃度均升高。通過中藥干預后，與模型組比較，西藥和盆痛靈高、中劑量組血清及腹腔液中NGF和IL-1β、TNF-α水平均降低，盆痛靈低劑量組血清中IL-1β降低，因此認為盆痛靈的作用機理可能跟調控NGF的水平、減少炎癥因子有關，但是否通過外周及中樞調控EMs疼痛的確切機制有待進一步的研究證實。