延經丸對去勢模型大鼠腎上腺皮質中Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

趙粉琴,李春瑤,劉曉莉,茍亞嬌,胡志霞,徐世倩,袁愛倩,張文靜

(甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 73000)

圍絕經期出現潮熱出汗，記憶力下降，煩躁易怒，心血管疾病以及情感障礙(抑郁或焦慮)等癥狀。目前普遍認為[1-2]，該癥狀的主因是女性卵巢功能衰退，雌激素水平低下，對下丘腦-垂體的負反饋抑制作用降低，繼發垂體功能一時亢進，引起下丘腦-垂體-卵巢軸(HPO軸)與下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA軸)功能紊亂有關。

中醫學認為腎腦相關，《素問·六節藏象論》《素問·五臟生成》《素問·陰陽應象大論》等篇章論述的“腎精生髓，髓通于腦”從髓的角度來說明腎與腦的關系[3]。近年來大多數學者對于腎腦相關理論的探討多由腎與腦血管、腦神經疾病入手，如補腎中藥對延緩腦組織衰老的研究、腦卒中與腎功能損害的研究等[4-6]。所以圍絕經期諸癥的出現腎虛為本，精虧血虛，不能濡養臟腑，出現一系列功能紊亂征象。

延經丸是甘肅省名老中醫牟惠琴教授的經驗方，由生地黃、熟地黃、菟絲子、紫河車、阿膠、枸杞子、白術、巴戟天、鹿角霜、山藥等藥物組成，具有補腎健脾功效。前期的研究表明[7-9]延經丸能明顯改善卵巢功能衰退后激素水平變化，提高女性體內雌激素的分泌，同時可以升高血清降鈣素水平，達到改善圍絕經期大鼠骨質疏松。說明補腎中藥對HPO具有明顯調控作用，具有改善女性卵巢子宮等性腺器官的功能，促進卵泡發育以及維持內分泌功能。但對HPA軸的調控作用研究較少，本研究通過實驗進一步探討延經丸能否改善腎上腺組織功能亢進，平衡激素分泌紊亂狀態，達到調理女性圍絕經期綜合征的主要作用。

1 材料和方法

1.1 動物模型分組及給藥

選用雌性SD大鼠，6月齡60只，體質量(200±20)g，由甘肅中醫藥大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SYXK(甘)2004-0006。隨機分成實驗組(50只)和正常組(10只)，實驗組采用雙側卵巢切除造模，術后第6天開始逐只每天進行陰道脫落細胞涂片，連續觀察3個動情期(15 d)，涂片呈現為動情周期紊亂、動情間期延長，為去勢大鼠。造模成功后大鼠再次隨機分為5組，每組10只：模型組，安定組，補佳樂組，延經丸高劑量組，延經丸低劑量組。補佳樂片(拜耳醫藥保健有限公司廣州分公司，批號：國藥準字J20130009)，成人用量：每日1 mg，換算成大鼠為6.3 mg/kg，補佳樂用蒸餾水配成0.63 mg/mL溶液。地西泮，成人用量：每日2.5 mg，換算成大鼠為15.75 mg/kg，用蒸餾水配成1.575 mg/mL溶液；延經丸，成人用量：每天9 g，配成50.50 g/mL溶液；大鼠藥劑量分別為25.25 g/200 g(5倍)、101 g/200 g(20倍)。各組按0.5～2 mL/200 g體質量，灌服相應藥液，連續42 d(6個周期)。

1.2 標本采集

最后一次灌服藥物24 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉，采用眼內眥靜脈叢采血法采血，每管收集1.5 mL血樣于 EDTA 抗凝管中。離心(1 200 r/min)10 min后，吸取上清置-80 ℃保存。后處死，剖取腎上腺組織，固定，包埋，切片，染色。

1.3 檢測指標

1.3.1 大鼠活動次數

用動物紅外自主活動測試儀，記錄透明飼養籠檢測大鼠自由活動時間，實驗選擇的采樣統計間隔時間為5 min，連續記錄動物自主活動量，結果以1 h自主活動累積量進行表示。抑制率計算：抑制率=(正常組活動量-監測組活動量)/正常組活動量×%。

1.3.2 檢測大鼠血清ACTH、CORT

應用ELISA方法在VERSA max酶標儀上測定血清內ACTH、COR 的含量，按照試劑說明書操作。

1.3.3 免疫組化SP法檢測腎上腺組織的Bax、Bcl-2表達

操作程序按SP試劑盒說明書進行。分別計數腎上腺皮質組陽性細胞數。按陽性細胞所占百分比及染色強度兩者結合分析判斷。陽性細胞所占百分比，即陽性細胞數≤25%為(+)，25%～50%為(++),>50%為(+++)，無陽性細胞(-)；染色強度：淺黃色為(+)，棕黃色(+ +)，棕褐色為(+++)，未著色細胞為(-)。每張切片至少觀察3個視野。強陽性率=+ +總數和+++表達總數之和。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠自主活動和抑制率比較

去勢后大鼠煩躁，自主活動明顯增加，與正常對照組、安定組、補佳樂組和延經丸高、低劑量組比較大鼠活動次數明顯增加，而延經丸能明顯抑制，大鼠活動減少(P<0.01)，尤其是延經丸高劑量組抑制率明顯(P<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠自主活動量和抑制率比較

注：與模型組比較，**P<0.01；與正常對照組比較,△P<0.01

2.2 各組大鼠入睡率和睡眠潛伏期比較

安定組、延經丸高、低劑量組入睡率明顯提高，與正常對照組、模型組之間比較都有明顯差異(P<0.01)，睡眠潛伏期延經丸高劑量與模型組、正常對照組、安定組比較差異有統計學意義(P<0.01)，見表2、圖2。

注：與模型組比較，**P<0.01；與安定組比較，▲P<0.05；與正常對照組比較，△P<0.01

表2 各組大鼠睡眠率和睡眠潛伏期比較

2.3 各組大鼠皮質醇水平比較

各組大鼠血清皮質醇含量比較，模型組大鼠血清ACTH和CORT含量增加，尤其是血清ACTH含量增加較為顯著，與正常組、補佳樂組、延經丸高、低劑量組之間比較都有明顯差異(P<0.01)，而血清CORT含量與正常組、延經丸高、低劑量組之間比較有差異(P<0.01)，結果見表3、圖3。

注：與模型組比較，**P<0.01

表3 各組大鼠血清皮質醇檢測結果比較

2.4 各組大鼠腎上腺組織結構比較

青年組大鼠腎上腺束狀帶與球狀帶之間的界限清晰，細胞形狀規則，排列有序，模型組大鼠的腎上腺束狀帶和球狀帶界限均出現明顯的模糊化，可分泌CORT的束狀帶細胞數量明顯增多，體積變大呈空泡狀，可能正處于功能亢進狀態。補佳樂組和延經丸高劑量組大鼠腎上腺束狀帶與球狀帶之間的界限逐漸清晰，細胞形狀規則，延經丸低劑量組和模型組之間差異不大，中間空泡狀組織增多，血運豐富。見圖4。

圖4 各組大鼠腎上腺組織結構

2.5 各組大鼠腎上腺皮質Bax和Bcl-2陽性表達的比較

見表4、圖5、圖6。

圖6 延經丸對大鼠腎上腺皮質Bax陽性表達的影響(400×)

表4 各組大鼠腎上腺皮質Bax和Bcl-2陽性表達的比較

3 討論

圍絕經期婦女卵巢功能衰竭，雌激素水平下降，導致調節內分泌的H-P-O神經內分泌軸紊亂，機體會產生應激性保護，引起 HPA軸興奮，刺激腎上腺分泌與釋放大量糖皮質激素[10](CRH、CORT，CORT 是 HPA 軸重要激素之一可調節人體的代謝、認知功能和情緒等[11])。HPA軸功能亢進，反過來抑制HPO，抑制雌激素分泌，導致植物神經功能紊亂，出現一系列的潮熱、出汗、失眠、抑郁甚至焦慮等情緒障礙，且糖皮質激素增高的程度與該病的發病程度密切相關[12]。也有研究表明[13-15]，使用雌激素可以通過抑制ACTH與CORT而起到抗抑郁的作用，進一步說明絕經期綜合征(尤其是情感障礙)與圍絕經期雌激素水平的低下，HPA軸功能亢進有關[16-17]。

中醫學認為婦女七七之年，腎氣衰，天癸竭，精血虛，氣血弱，沖任不顧，臟腑功能異常，腎陰陽失調。腎主藏精為先天之本，精化氣，氣生精，精生血，精血同源相互滋生。絕經期腎氣虛衰，腎之精血虛損，即天癸竭，傷及五臟六腑。

延經丸，主要由生地黃、熟地黃、菟絲子、紫河車、阿膠、枸杞子、白術、巴戟天、鹿角霜、山藥等藥物組成。以生地黃、熟地黃、鹿角霜、枸杞子、巴戟天、菟絲子、紫河車補腎壯陽，益精生髓，陰陽雙補，符合腎藏精，寓水火與一臟的理論；用枸杞子、阿膠補養肝血；白術、山藥健脾益氣，以補后天之氣，提高人體消化吸收的能力。延經丸組方從多臟腑補益調節著手，以補腎陰為主，陰陽并補，健脾益氣為輔，先天與后天相輔相成，體現了中醫的整體觀念的思想，根據肝腎同源，精血同源的理論，腎精充足，肝血有藏，髓海得養，記憶力恢復，情緒平緩。

本研究表明延經丸可以改善卵巢功能下降后刺激引起的腎上腺功能亢進狀態，大鼠自主活動減少，睡眠時間延長，與模型組比較差異有統計學意義，同時去勢大鼠血清ACTH和CORT明顯增高，說明存在HPA 軸亢奮狀態，而延經丸和補佳樂組能抑制糖皮質激素的水平,與模型組比較差異有統計學意義。通過組織病理學表現分析去勢大鼠腎上腺束狀帶和球狀帶界限不清晰,束狀帶細胞數量明顯增多,呈空泡狀,表面以上組織均存在明顯損傷，腎上腺皮質層中Bax強表達，bcl-2弱表達，延經丸和補佳樂組能抑制腎上腺皮質層Bax的表達，提高bcl-2的表達，各組之間比較有差異。進一步說明延經丸能夠下調異常增高的糖皮質激素，大大改善平衡和改善機體應激狀態。機體產生應激性保護，引起HPA 軸亢奮，而興奮的 HPA 軸抑制HPO軸的功能，雌激素和延經丸都可以抑制亢奮的HPA軸，尤其以延經丸高劑量組作用最顯著。

當 HPA 軸長期處于亢進狀態，可導致神經內分泌異常和情感異常行為的發生[18]。所以針對圍絕經期出現腎上腺亢進引起的煩躁易怒，以及情感障礙的患者，在中醫治療上，可以通過“補益肝腎”的治療原則，來調節HPO軸與HPA軸之間的功能紊亂，從而緩解圍絕經期出現一系列綜合征。