Tim-3/Galectin-9通路、Foxp3在口腔扁平苔蘚患者外周血單個核細胞中的表達及意義

王冬平　羅亮　劉莉　王珣　蔡揚

[摘要] 目的 探討Foxp3與T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3（Tim-3）、半乳糖凝集素-9（Gal-9）的相關性及Tim-3/Gal-9通路在口腔扁平苔蘚（OLP）發病機制中的意義。 方法 選擇2015年9月—2016年9月貴州醫科大學附屬醫院口腔黏膜病專科門診收治的OLP患者58例為OLP組（非糜爛型36例，充血糜爛型22例），選擇貴州醫科大學附屬醫院同期收治的17名健康人為正常組。采用實時熒光定量PCR技術檢測兩組Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA在外周血單個核細胞中的表達水平，并分析三種因子相關性。 結果 Tim-3 mRNA和Foxp3 mRNA的相對表達量在非糜爛型及充血糜爛型OLP患者中均比正常組高（P < 0.05）;Gal-9 mRNA的相對表達量在各型OLP中與正常組比較，差異均無統計學意義（P > 0.05）;Foxp3與Tim-3、Gal-9均呈正相關（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3與Gal-9呈正相關（r = 0.453，P = 0.018）。 結論 Tim-3/Gal-9信號通路介導的Th1細胞凋亡可能是OLP誘導Th2免疫偏移的機制之一，可能參與了OLP細胞免疫調節。

[關鍵詞] 口腔扁平苔蘚;T細胞免疫球蛋白域黏蛋白域蛋白-3;半乳糖凝集素-9;Foxp3;實時熒光定量PCR

[中圖分類號] R781.5 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）08（c）-0004-04

The expression and significance of Tim-3/Galectin-9 pathway and Foxp3 in the peripheral blood mononuclear cells of oral lichen planus patients

WANG Dongping1 ? LUO Liang2 ? LIU Li3 ? WANG Xun2 ? CAI Yang2

1.Department of Stomatology， Dalian Friendship Hospital， Liaoning Province， Dalian ? 116011， China; 2.Department of Periodontal Mucosa， Stomatological Hospital of Guizhou Medical University， Guizhou Province， Guiyang ? 550004， China; 3.Department of Oral Medicine， Guizhou Provincial People′s Hospital， Guizhou Province， Guiyang ? 550002， China

[Abstract] Objective To study the correlation between Foxp3 and T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3 （Tim-3） and Galactosin -9 （Gal-9） in order to discover the role of Tim-3/Gal-9 pathway in the pathogenesis of oral lichen planus （OLP）. Methods From September 2015 to September 2016， 58 OLP patients admitted to the specialized Outpatient Department of Oral Mucosal Disease of the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University were selected as the OLP group （36 cases of non-erosive type and 22 cases of hyperemia type）. And 17 healthy subjects admitted to the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University during the same period were selected as the normal group. The expression levels of Tim-3， Gal-9 and Foxp3 mRNA in peripheral blood mononuclear cells of the two groups were measured by real-time quantitative polymerase chain reaction， and the correlation of the three factors was analyzed. Results The relative expression levels of Tim-3 mRNA and Foxp3 mRNA in non-erosive OLP and hyperemic OLP were higher than those in the normal group （P < 0.05）. The relative expression levels of Gal-9 mRNA in all OLP types were not significantly different from those in the normal group （P > 0.05）. Foxp3 was positively correlated with Tim-3 and Gal-9 （r = 0.738， P = 0.000; r = 0.443， P = 0.010）; there was a positive correlation between Tim-3 and Gal-9 （r = 0.453， P = 0.018）. Conclusion Tim-3/Gal-9 signaling mediated Th1 cell apoptosis may be one of the mechanisms by which OLP induces Th2 immune migration， and may be involved in the immune regulation of OLP cells.

[Key words] Oral lichen planus; T cell immunoglobulin domain mucin domain protein-3; Galectin-9; Foxp3; Real time polymerase chain reaction

口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）是口腔黏膜病中常見的慢性炎癥性疾病，其發病機制尚不明確。目前，研究認為OLP是T細胞介導的自身免疫性疾病[1]，其中CD4+T淋巴細胞中的輔助性T細胞（T helper cell，Th）1和Th2兩個亞群之間的失衡可能參與了OLP的發病[2]。也有研究[3]表明，調節性T細胞可能通過導致扁平苔蘚患者免疫功能紊亂參與了扁平苔蘚的發生。T細胞免疫球蛋白與黏蛋白域基因（T cell immunoglobin domain and mucin domain protein，Tim）家族因其特殊的結構和表達特性，成為Th1/Th2細胞特異性的表面標志之一，參與了T細胞分化和免疫應答的調節。本研究通過檢測貴州醫科大學附屬醫院收治的58例OLP患者Tim-3、半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）、Foxp3 mRNA在外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中的表達水平，分析Foxp3與Tim-3、Gal-9表達的相關性，探討Tim-3/Gal-9通路在OLP免疫發病機制中的作用及意義，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要儀器及試劑

Gene Quant100核酸蛋白分析儀;美國Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀;淋巴細胞分離液、Trizol試劑、逆轉錄試劑盒（047A）、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。上海生工生物工程有限公司設計并合成引物。

1.2 研究對象

選擇2015年9月—2016年9月貴州醫科大學附屬醫院口腔黏膜病專科門診收治的OLP患者58例作為研究對象，設為OLP組，其中非糜爛型36例，男15例，女21例;年齡29～72歲，平均（46.0±14.9）歲。充血糜爛型22例，男11例，女11例;年齡12～76歲，平均（48.0±18.1）歲。同時選擇于貴州醫科大學附屬醫院同期體檢中心體檢的17名健康人員作為正常組，男8名，女9名;年齡18～78歲，平均（46.5±17.8）歲。兩組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.3 納入及排除標準

納入標準：①局部或全身均未使用過調節免疫、抗生素等相關制劑;②經病理確診;③知情同意并簽署知情同意書。排除標準：①經期或孕期婦女;②口腔檢查有炎癥及患有其他口腔黏膜病或腫瘤等;③伴皮膚損傷;④合并系統性疾病。本研究已通過醫院醫學倫理委員會的審核批準。

1.4 方法

抽取兩組空腹靜脈血5 mL，乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。采用淋巴細胞分離液經Ficoll密度梯度離心法分離PMBCs，Trizol試劑提取總RNA，通過紫外分光光度計檢測分離的總RNA的吸光度值（OD）為1.8～2.0，分別測量各標本的總RNA濃度并計算所需RNA體積。采用Rt-PCR逆轉錄試劑盒獲取cDNA，采用SYBR Green實時熒光定量PCR試劑盒，按操作說明檢測Foxp3、Tim-3、Gal-9 mRNA相對表達量。PCR反應條件：預變性95℃，30 s;變性95℃，5 s;退火及延伸6℃，30 s，進行40個循環。采用2-△Ct法分析各目標基因的相對表達定量，△Ct = Ct（目的基因）-Ct（內參基因），OLP組較正常組增高或降低的倍數=2-△Ct（OLP組25%～75%均值）/2-△Ct（正常組25%～75%均值）。引物序列見表1。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析。計量資料為非正態分布資料用中位數和四分位數[M（P25，P75）]表示，各組間比較采用Kruskal-Wallace檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U檢驗。相關性用Spearman分析。計數資料采用χ2檢驗，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Tim-3、Gal-9、Foxp3 mRNA的表達水平

OLP組患者Tim-3 mRNA的相對表達量高于正常組，差異有統計學意義（Z = 3.303，P = 0.001），上調倍數約為2024倍。OLP組患者中，非糜爛型OLP患者Tim-3 mRNA的相對表達量較正常組升高，差異有統計學意義（Z = 3.201，P = 0.001），上調倍數約為2594倍;OLP組中，充血糜爛型患者中Tim-3 mRNA的相對表達量較正常組升高，差異有統計學意義（Z = 2.634，P = 0.008），上調倍數約為1090倍。OLP患者外周血中Gal-9 mRNA的相對表達量較正常組增高，但差異無統計學意義（P > 0.05）。OLP組Foxp3 mRNA的相對表達量高于正常組，差異有統計學意義（Z = 3.252，P = 0.001），上調倍數約為34倍。OLP組患者中，非糜爛型Foxp3 mRNA的相對表達量較正常組升高，差異有統計學意義（Z = 3.301，P = 0.001），上調倍數約為46倍;充血糜爛型OLP患者Foxp3 mRNA的相對表達量高于正常組，差異有統計學意義（Z = 2.455，P = 0.014），上調倍數約為20倍。見表2。

2.2 OLP患者外周血中Tim-3、Gal-9、Foxp3相關性分析

相關性分析結果顯示：OLP患者外周血中Foxp3的表達與Tim-3、Gal-9均呈正相關（r = 0.738，P = 0.000;r = 0.443，P = 0.010）;Tim-3與Gal-9呈正相關（r = 0.453，P = 0.018）。

3 討論

OLP是口腔黏膜病中一種常見的慢性炎癥性疾病，目前關于其病因和發病機制尚無定論，但其病理表現具有典型的慢性炎癥特征，并且可引起相關免疫學分子標志物的改變[4]。Th1/Th2的失衡表達與OLP發病機制密切相關。本課題組前期研究結果提示：OLP患者外周血中Th1型細胞因子的表達水平無明顯改變，Th2型細胞因子顯著升高，呈現Th2占優勢的免疫應答。由此可以推測，Th1/Th2平衡向Th2漂移可能抑制了宿主細胞的免疫應答，從而導致OLP的慢性炎癥[5]。

Tim-3作為一種負性免疫調節分子，是免疫球蛋白和黏蛋白結構域家族細胞的表面分子，其廣泛參與過敏、哮喘、自身免疫性疾病及腫瘤等疾病的免疫調節過程[6]。Khademi等[7]研究發現，Tim蛋白可能涉及Thl和Th2細胞介導的疾病。

Tim-3基因是第一個被發現參與T細胞免疫應答的Tim基因家族成員，是Tim家族激活誘導的抑制性受體，主要表達在分化成熟的Th1細胞中[8]，在免疫應答過程中發揮抑制性調節作用，從而有效調節T細胞凋亡以及免疫耐受過程[9-11]。Gal-9是Tim-3的天然配體，是半乳凝集素家族成員之一，主要表達于抗原遞呈細胞、巨嗜細胞及CD4+T細胞以及Treg。Gal-9與Th1細胞上的Tim-3分子特異性結合后，對機體的免疫細胞尤其是Th1細胞的定位、分化趨勢及分泌功能等產生影響，從而改變機體的正常免疫功能，從而延緩和/或促進疾病的發生、發展[12]。何澤現等[13]研究表明，外周血單核細胞上Tim-3可能通過調節IL-12產生間接調節Th1/Th2平衡。亦有研究表明[14]，在骨肉瘤患者的T細胞和單核細胞中Tim-3與Gal-9相互作用于免疫抑制反饋回路，從而抑制Th1反應。

在本研究中，OLP患者Tim-3 mRNA的表達高于正常組，Gal-9 mRNA的表達也有增高的趨勢，兩者表達量的增加使得二者結合力增強，Tim-3/Gal-9通路激活可以引起CD4+T細胞的失能[15]，降低細胞免疫，進而導致疾病的發生。目前，已有實驗證實，Tim-3/Gal-9通路可以選擇性地下調γ干擾素（IFN-γ）表達水平，明顯抑制Thl型細胞介導的免疫反應[16]。由此推測，Tim-3及其配體Gal-9可能與IFN-γ相互作用，共同參與了OLP免疫病理變化。就本研究而言，可能是OLP患者外周血中大量分泌的T-bet[17]上調了Tim-3的表達，經Tim-3/Gal-9通路反饋性地抑制CD4+及CD8+T細胞，促進該類細胞死亡，CD8+T細胞缺乏抑制性T細胞，不能有效抑制細胞免疫與體液免疫的功能，免疫監視和負反饋的能力下降，從而導致機體免疫功能出現紊亂，進而導致疾病的發生。這與本課題組前期觀察到的OLP患者外周血CD4+及CD8+T細胞數目與健康人相比減少是一致的[18]。還有研究表明：Gal-9/Tim-3信號的強弱對自然殺傷細胞活化和功能的發揮產生不同的影響，信號較弱時，自然殺傷細胞的殺傷功能增強;信號較強時，自然殺傷細胞的殺傷功能減弱[19]。本研究中，Tim-3的大量表達，使得這一通路信號過強，對自然殺傷細胞的功能發揮抑制作用或誘導其凋亡，從而減少自然殺傷分泌IFN-γ等細胞因子，進而導致Th1細胞數量降低，而Th2細胞數量占優勢。

Treg是一種特定細胞亞群，具有免疫調節功能。研究證實，Treg通過抑制其他T細胞活化發揮其主要功能，降低機體免疫應答的程度，縮小免疫應答范圍并縮短作用時間，從而有效阻止了自身抗原的炎癥反應的發生，同時抑制機體自身免疫病發展，因而在抑制發生自身免疫性疾病及維持機體免疫平衡方面備受關注。本課題組前期研究結果已顯示Treg細胞與OLP病損形成有關[20]。Foxp3屬于Foxhead家族分叉頭/翼狀螺旋轉錄調節因子，這一里程碑的發現為Treg細胞研究打開了一扇新的“門”，是免疫生物學重要的進步。研究證實，Foxp3能夠調節Treg細胞的發育及功能[21]。Tim-3可通過調節Treg細胞而參與炎癥性疾病、過敏、哮喘、自身免疫性疾病等的免疫調節，并在凋亡細胞的清除及免疫自穩功能中具有重要作用[22]。本研究中OLP患者外周血中Foxp3表達增高，并與Gal-9、Tim-3的表達呈正相關。提示Treg水平的改變與機體免疫平衡紊亂有關，高表達的Foxp3是Treg發揮免疫抑制功能所必需的，既然Gal-9表達于Treg表面，因此，推測Treg可能通過Tim-3/Gal-9通路抑制T細胞增殖。在本研究中，Tim-3、Gal-9表達呈正相關（P < 0.05），Gal-9 mRNA的表達雖有增高的趨勢，但差異無統計學意義（P > 0.05）。這可能與OLP的樣本量有關，尤其是充血糜爛型OLP，在以后的研究過程中，課題組將擴大樣本量進一步證實Gal-9表達情況。

綜上所述，本研究結果顯示，OLP偏離為Th2細胞介導的優勢應答，其機制可能與Tim-3/Gal-9信號通路介導的促Th1細胞凋亡有關，從而使得Th1型細胞因子的分泌減少，Th1型免疫應答受到抑制。Tim-3 /Gal-9信號通路介導的Th1細胞凋亡可能是OLP誘導Th2免疫偏移的機制之一，深入研究Tim-3/Gal-9通路對免疫細胞生長、分化和凋亡的調節作用，探索OLP復雜的免疫病理變化，將為OLP和其他自身免疫性疾病的診斷與治療提供新的思路。

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（收稿日期：2019-04-01）