長鏈非編碼RNAROR1-AS1促進骨肉瘤細胞侵襲的機制研究

張勇

[摘要] 目的 探討長鏈非編碼RNA（lncRNA） ROR1-AS1對骨肉瘤（OS）侵襲能力的影響。 方法 RT-PCR檢測成骨細胞和OS細胞株中lncRNA ROR1-AS1和ROR1的表達;行細胞轉染，觀察細胞生長情況，再過表達ROR1，Transwell和劃痕實驗檢測細胞侵襲能力;Western-blot檢測上皮間質轉化相關分子標志物E-caderin、N-caderin、abcam的表達。 結果 與成骨細胞比較，OS細胞中lncRNA ROR1-AS1和ROR1高表達（P < 0.01）;抑制lncRNA ROR1-AS1后，OS細胞中ROR1的mRNA表達下調（P < 0.05）;Transwell和劃痕實驗顯示細胞侵襲能力減弱，過表達ROR1后侵襲能力恢復（P < 0.05）;抑制lncRNA ROR1-AS1后上皮表型標志物E-caderin表達降低，間質表型標志物N-caderin表達增高;過表達ROR1后呈現相反結果。 結論 LncRNA ROR1-AS1促進OS細胞侵襲依賴ROR1。

[關鍵詞] 骨肉瘤;長鏈非編碼RNA ROR1-AS1;ROR1;侵襲;上皮間質轉化

[中圖分類號] R738.1? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2020）08（a）-0025-04

[Abstract] To investigate the effect of lncRNA ROR1-AS1 on the invasion ability of osteosarcoma （OS）. Methods RT-PCR detected the expression of lncRNA ROR1-AS1 and ROR1 in osteoblasts and OS cell lines; cell growth was observed after cell transfection， ROR1 was overexpressed， and cell invasion ability was detected by Transwell and scratch test. The expression of epithelial to mesenchymal transformation -related molecular markers （E-caderin， N-caderin， abcam） was detected by Western-blot. Results LncRNA ROR1-AS1 and ROR1 were highly expressed in OS cells compared with osteoblasts （P < 0.01）. After lncRNA ROR1-AS1 was inhibited， mRNA expression of ROR1 in OS cells was down-regulated （P < 0.05）. After OS cells knocked down lncRNA ROR1-AS1， Transwell and scratch experiments confirmed that the invasion ability of cells was weakened， while the invasion ability was restored after overexpression of ROR1 （P < 0.05）. After lncRNA ROR1-AS1 inhibition， the expression of epithelial phenotypic marker E-caderin was decreased， while that of mesenchymal phenotypic marker N-caderin was increased. Overexpression of ROR1 presents the opposite effect. Conclusion LncRNA ROR1-AS1 promotes OS cell invasion dependent on ROR1.

[Key words] Osteosarcoma; lncRNA ROR1-AS1; ROR1; Invasive; Epithelial to mesenchymal transformation

骨肉瘤（osteosarcoma，OS）發病年齡輕，致死率高[1-2]，易轉移[3]。手術和化療雖有一定效果，但死亡率和轉移率仍然居高不下[4-5]。因此，闡明OS的侵襲機制，尋找生物標志物，至關重要。非編碼RNA在腫瘤的發展中占據重要地位[6]。長鏈非編碼RNAs（long noncoding RNAs，lncRNAs）包含200個以上核苷酸，從表觀遺傳學、轉錄和轉錄后調控等層面參與生物體的調控過程[7-9]，并通過多種機制影響基因和蛋白的表達[10-12]。本研究發現lncRNA ROR1-AS1在OS中過表達，并探討其在OS細胞侵襲中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人成骨細胞NHOst和人OS細胞株HOS、Saos-2、U20S和MG63（購自ATCC）。胎牛血清（TBD，中國）、DMEM培養基（Gibico，美國），無菌培養箱（Thermo，美國）;lncRNA ROR1-AS1的si-RNA慢病毒、對照病毒、ROR1過表達質粒，定量引物（Genechem，中國）;PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]，SYRB Green染料（Invitrogen，美國，S7563）及逆轉錄試劑盒（TakaRa，日本，RR037A）。Transwell小室（Corning，美國），稀釋基質膠（BD，美國），Lipofectamine 2000 （Invitrogen，美國，11668027），PCR儀（ROCHE，瑞士）;抗體ROR1，E-caderin，N-caderin，抗體（abcam，美國，ab135669、ab76 055、ab18203，1∶400）。

1.2 細胞培養

含10%胎牛血清的DMEM培養基（含青鏈霉素）培養細胞，克隆至70%～80%更換培養基;培養箱條件：37℃、50 mL/L CO2。

1.3 RT-PCR

檢測各細胞株中lncRNA ROR1-AS1的表達。TRIzol法提總RNA，并檢測純度及濃度。依據TaKaRa公司說明書進行逆轉錄和PCR反應。反應體系20 μL： 2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL;上、下游引物各0.4 μL;cDNA 5 μL;雙蒸水4.2 μL。設定程序為兩步法RT-PCR：預變性 95℃，1 min;之后每一步變性95℃，5 s;退火延伸 60℃，20 s;共進行40個循環。每次在延伸階段讀取吸光值。lncRNA ROR1-AS1的上游引物序列為5′-CTGACGAAACACTGGAACTC-3′，下游引物序列為5′-GTCTGATTTGGTAGCTTGGATG-3′;ROR1的上游引物序列為5′-CAGATGAGTATGAAGAAGATGG-3′，下游引物序列為5′-ATGGCGAAC-TGAGAACAC-3′;U6作為內參進行相對定量，U6的上游引物序列為5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3′，下游引物序列為5′-CACTATTGCGGGCTGC-3′。采用2-△△Ct法計算兩者的相對表達量，重復3次。

1.4 細胞轉染

依據基因轉染操作手冊，采用Lipofectamine 2000將過表達和沉默載體（si-lncRNA ROR1-AS1#1，si-lncRNA ROR1-AS1#2）轉染進入細胞。經48 h轉染后，觀察細胞生長情況，收集細胞用于進一步研究。

1.5 Transwell

37℃無菌條件下，50 μg 細胞外基質（ECM）膠加入8 μm孔徑的Transwell小室，放置6 h進行包被;ECM膠充分凝固后，于上室加入不含抗生素及血清的培養基，接種細胞2×105個/孔，下室加入含10%血清無抗生素的培養基;24 h后取出小室，無菌棉簽擦拭去除上室內的細胞，1%結晶紫染液對小室多孔膜下表面的細胞染色，拍照，計數。染色的細胞穿膜越多，代表侵襲能力越強。

1.6 劃痕試驗

細胞接種于6孔板，垂直于孔板采用100 μL槍頭制作細胞劃痕，確保各個劃痕寬度基本一致。去除培養液，PBS沖洗孔板，去除細胞碎片。加入不含血清培養基，拍照記錄。培養板置入培養箱24 h后，再分別拍照記錄，計算劃痕距離百分比。

1.7 Western-blot

提取細胞總蛋白，制備8%聚丙烯酰胺凝膠，每孔20 μg上樣;80 V積層膠，120 V分離膠進行電泳，100 V轉膜90 min，5% BSA封閉PVDF膜1 h，加一抗，4℃振蕩過夜。TBST洗滌后滴加二抗，37℃孵育1 h，顯影成像。特異性條帶凈灰度值由Image J軟件獲取。

1.8 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行統計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，計數資料采用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA ROR1-AS1和ROR1在人正常成骨細胞和人OS細胞株中的表達情況

2.2 抑制lncRNA ROR1-AS1表達后lncRNA ROR1-AS1和ROR1表達變化

HOS和MG63中轉染lncRNA ROR1-AS1的siRNA后，lncRNA ROR1-AS1表達量明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）;同時，ROR1的表達量也隨之下降（P? < 0.05或P < 0.01）。si-lncRNA ROR1-AS1#1具有更好的沉默效能，用于后續實驗。見圖2。

2.3 lncRNA ROR1-AS1、ROR1對OS細胞侵襲轉移能力的影響

2.4 lncRNA ROR1-AS1經由ROR1介導OS細胞上皮間質轉化

檢測lncRNA ROR1-AS1對上皮間質轉化（EMT）的影響，抑制lncRNA ROR1-AS1表達，間質表型標志物N-cadherin表達下降，而上皮表型標志物E-cadherin表達上調;過表達ROR1后，N-cadherin表達上升，而E-cadherin表達下降。見圖5。說明lncRNA ROR1-AS1經由ROR1參與OS的EMT。

3 討論

腫瘤侵襲是造成患者死亡的主要原因[13]。而EMT是腫瘤侵襲中的重要環節，上皮細胞標志物表達下降，間質細胞標志物表達升高，便于腫瘤細胞從原發灶脫離，出現侵襲轉移[14]。ROR1的功能在神經系統、循環系統和呼吸系統的中首先發現[15]。ROR1在OS等腫瘤中過表達，同腫瘤病理過程相關[16]。ROR1可以促進EMT和誘導增殖、遷移[17]。Dai等[18]指出ROR1通過非經典wnt信號通路參與OS的侵襲。

LncRNA ROR1-AS1位于人基因組1p31.3，是ROR1基因轉錄的反義lncRNA。Hu等[19]首次對其功能進行報道：可與EZH2/PRC2結合參與基因轉錄調控[19]。lncRNA可通過順式作用調節臨近的基因的轉錄[20]，所以我們推測lncRNA ROR1-AS1可通過調控ROR1參與OS的侵襲。

本研究顯示，lncRNA ROR1-AS1在OS中過表達，抑制lncRNA ROR1-AS1表達，ROR1表達量隨之下降，OS細胞的侵襲能力下降，EMT的上皮表型標志物表達增高，而間質表型標志物表達降低;在此基礎上過表達ROR1，OS細胞的侵襲能力恢復，EMT上皮表型標志物表達下降，間質表型標志物表達升高;提示lncRNA ROR1-AS1對OS細胞的侵襲作用的調控是依賴ROR1的。但其具體分子結合位點及轉錄調控機制，仍需在后續研究中進一步探討。

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（收稿日期：2020-02-12）