有機垃圾厭氧產氫及其氫化酶影響因素探究

曾靜，趙興玲，柳靜，劉士清，吳凱，王昌梅，楊紅，尹芳，張無敵

（云南師范大學 能源與環境科學學院，云南 昆明 650500）

有機垃圾，是指生活垃圾中含有有機物成分的廢棄物。從2017年3月開始，隨著 《生活垃圾分類制度實施方案》的發布，垃圾分類開始在全國各地進行推廣。據統計，約80%～90%的城市將有機垃圾納入分類類別［1］。由于其數量不斷增加，對有機垃圾的處理也顯得尤為重要。有機垃圾底物中富含碳水化合物，相關報道碳水化合物是發酵生物制氫的較優底物［2］。因此，通過發酵生物制氫技術處理有機垃圾不僅實現了污染物的處理，同時還實現了氫源的回收［3］。

目前，許多學者對有機垃圾進行了大量研究。王勇等［4］學者研究了初始pH和溫度對餐廚垃圾厭氧發酵制氫的影響；賈璇等［5］學者在濕熱預處理對餐廚垃圾生物制氫潛力的影響方面進行了研究；高常卉等［6］學者研究了餐廚垃圾厭氧干發酵的產氫特性。可以發現，在垃圾發酵產氫的影響因素、厭氧消化方式、預處理等方向已做了相關研究。但是，針對有機垃圾發酵制氫過程中氫化酶的影響因素的探究鮮有報道。

發酵制氫是在氫酶的催化作用下，有機物被產氫微生物利用降解產生氫氣，同時生成揮發性脂肪酸 （VFA）、乙醇等代謝產物的過程［7］。氫酶也稱為氫化酶，是一類存在于微生物體內的生物酶，它能可逆催化氫氣的氧化還原反應［8］。氫化酶是能量代謝過程中氫釋放的最后限速酶系，在產氫代謝過程中發揮著重要作用［9］。根據氫化酶的催化功能可分為三類［10］：產氫氫化酶、耗氫氫化酶、雙向性氫化酶，其中產氫氫化酶能夠表征產氫系統中的產氫能效［11］。在微生物代謝產氫的過程中，影響氫化酶活性的影響因子有很多，如溫度、pH、m（C）／m（N）、金屬離子、底物濃度等。

本研究通過設置不同發酵料液含量的有機垃圾進行發酵制氫，得出制氫過程中的產氫潛力，并對整個過程產氫量和氫化酶活性之間的變化關系以及氫化酶的影響因素進行了探究。得出不同濃度有機垃圾產氫過程中氫化酶的影響因素，為后期控制多因素對氫化酶的影響從而提高有機垃圾產氫效率的研究提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗原料來源于云南師范大學能環學院辦公室內日常丟棄的有機垃圾。為保證每批次原料組成成分相同，有機垃圾按m（果皮）∶m（剩飯）∶m（廢棄菜葉）∶m（茶渣） ＝1∶1∶1∶1進行配比。其相關理化性質如表1所示。接種物是在取部分實驗室長期馴化的接種物的基礎上，再加入少量有機垃圾和豬糞作為營養物，在35±1℃下恒溫馴化，從而達到使用要求。經測定，接種物TS為12.87%，VS為59.78%，pH為7。

表1 有機垃圾的理化性質Table 1 Physical and chemical properties of kitchen waste

1.2 實驗裝置

采用自行設計的批量式反應裝置，由500mL的厭氧發酵瓶、排水瓶和集氣瓶和溫控系統組成。厭氧發酵瓶作為反應容器，其有效容積為400mL，整個過程通過恒溫磁力攪拌水浴鍋控制厭氧反應溫度，保持在35±1℃。裝置示意圖如圖1所示。

圖1 實驗裝置示意圖Fig 1 Schematic diagram of the experimental device

1.3 實驗設計

本實驗設定溫度為35±1℃，其中設置了三個實驗組和一個空白組，每組均重復設置三個平行實驗，具體發酵料液的配制如表2。

表2 發酵料液配比Table 2 Ratio of fermentation liquid

1.4 測定方法

通過每天測量排水量記錄每個處理的沼氣產量［12］。采用福立GC9790II型氣相色譜儀測定各處的氫氣濃度，甲烷濃度和揮發性脂肪酸含量［13］。pH值、TS和VS是根據實驗室以往所采用的方法測量的［14］。粗纖維采用國家標準 （GB6434-86）所描述方法進行測定。粗蛋白采用凱式定氮法［15］進行測定。m（C）／m（N）中C利用TOC-2000儀進行測定，N用凱式定氮法進行測定。

產氫氫化酶活性的測定：首先在酶試劑盒中加入待測樣品10μL和甲基紫精試劑40μL混勻，封板后37℃反應30min。洗滌液洗板5次加入HRP酶標試劑50μL，封板后37℃反應30min。再洗板5次加入TMB顯色劑和酸顯色劑37℃顯色10min。最后加入終止液終止反應，顏色的深淺和樣品中的氫化酶呈正相關。15min內使用酶標儀在450nm波長下測定吸光度 （OD值）。

2 結果與討論

2.1 不同濃度的有機垃圾的制氫潛力

從實驗發酵開始，每隔12h記錄一次產氣量和測定其沼氣中的氫氣含量，整理數據并進行繪制，如圖2所示。

圖2 不同濃度有機垃圾氫氣變化圖Fig 2 Changes of hydrogen in kitchen waste at different concentrations

圖2（a）為三個實驗組過程中單位產氫量及氫氣含量變化圖，圖2（b）為累積產氫量圖。從圖2（a）發現，各實驗組氫氣含量的整體變化均呈現出先上升后下降再上升最后下降的趨勢，且每個實驗組都出現了兩個峰值。有機垃圾中的有機質主要包括碳水化合物、蛋白質和脂肪等，碳水化合物相對于蛋白質和脂肪更容易被微生物利用，因此在整個反應過程中碳水化合物會優先被利用［16］。伴隨著原料內的大量碳水化合物被利用，8%和10%實驗組在第24h出現第一個峰值，此時為氫氣含量最大值，分別為46%、50%。由于原料增多，水解速度相對較緩，12%實驗組在第36h出現第一個峰值，也為最大峰值，為49%。隨著碳水化合物的消耗，此時微生物開始利用原料內的蛋白質等大分子物質制氫，8%、10%、12%實驗組分別在第60h、72h、72h出現第二個氫含量峰值，此后氫含量開始下降，但始終保持在30%左右。單位產氫量呈現出現上升后下降的趨勢，所有實驗組單位產氫量的峰值與氫氣含量峰值出現的時間一致，說明此時體系內產氫微生物處于最佳活躍狀態，不斷利用有機質進行代謝產氫。此后單位產氫量開始下降趨于平緩，直至產氫結束。從圖2（b）看出，8%和10%實驗組發酵共進行了96h，12%進行了108h。8%和10%實驗組在發酵前72h累積產氫量顯著增加，12%實驗組在前84h累積產氫量顯著提高，均占總累積產氫量的95%以上。隨后，各實驗組累積產氫量增長緩慢直至結束。其中，8%實驗組產氫率為154mL／g，10%實驗組產氫率為139mL／g，12%實驗組產氫率為132mL／g。可以發現，隨著原料添加量的增加，產氫率逐漸降低，發酵時間相應有所增加。

修正的Gompertz方程可以用來描述厭氧發酵過程中的產氫情況［17］，方程如 （1）：

式中：y（t）表示時間t時的累積產氫量 （mL），當t→∞時，y（t）→a，有Hm＝a為最大累積產氫量 （mL）；Rm＝a·c/e為最大產氫速率 （mL／h）；λ＝（b-1）/c，λ為發酵滯留時間 （h）。e為exp（1）＝2.71828。實際數據處理過程中，利用origin軟件對參數a、b、c進行擬合，然后轉換為Hm、Rm、λ的值，如表3。

表3 有機垃圾發酵制氫的動力學參數Table3 Kinetic parameters of hydrogen production from kitchen waste fermentation

由表可知，三個實驗組經過方程擬合后的相關系數R2均大于0.99，說明修正的Gompertz方程能很好的描述有機垃圾發酵制氫過程中的產氣情況。各實驗組的累積產氫量和TS產氫率與實際值基本接 近，TS產 氫 率 分 別 為154mL／g、137mL／g、132mL／g，8%實驗組產氫率高于其余兩個實驗組。最大產氫速率分別為39mL／h、65mL／h、84mL／h，12%實驗組產氫速率最快。可以發現，濃度越高的實驗組雖然產氫速率更快但是其TS產氫率卻較低，可能出現的原因是原料添加量的增加，微生物在水解酸化階段反應相對較緩，導致體系內酸物質的積累從而影響產氣。三個實驗組的發酵滯留時間相差不大并且時間都較短，說明利用垃圾作為原料發酵制氫能較快的啟動實驗。

2.2 有機垃圾發酵制氫發酵類型

液相末端發酵產物在厭氧發酵產氫過程中能夠反映系統內的代謝特征和微生物群落結構變化，不同的液相末端發酵產物組成也代表著系統內不同的發酵類型［18］。圖3表示了不同發酵濃度發酵過程中VFAs的變化，觀察到所有實驗組在開始發酵前系統內液相產物主要以乙酸為主，含量均高達80%以上，并含有少量其他脂肪酸。隨著實驗的進行，各實驗組的揮發性脂肪酸含量均發生了變化。其中，所有實驗組結束后系統內液相末端產物主要由乙酸和丁酸居多，二者之和高達96%以上。因此，有機垃圾為原料的厭氧發酵產氫類型為丁酸型發酵。宋佳秀等［20］認為丁酸型發酵是產氫最有效的發酵類型之一。在實驗過程中除乙酸、丁酸外，還伴隨著少量的丙酸、戊酸、異丁酸等末端液相產物生成。發酵結束后8%實驗組中丁酸占比較發酵前增加了32%，10%實驗組中丁酸占比較發酵前增加了52%，12%實驗組中丁酸占比較發酵前增加了50%。結合圖3中氫氣含量變化發現，丁酸占比增加得多，相應實驗組氫氣含量峰值越高，丁酸的產生一定程度上可以調節由于乙酸積累產生的NADH+H+和NAD+之間的一種生理上的平衡，從而促進產氫細菌的作用［21］。

圖3 各實驗組中VFA各組分隨時間的變化Fig 3 Changes of VFA components in each experimental group over time

2.3 產氫量與氫化酶活性之間的變化

在發酵制氫的能量代謝過程中，氫化酶作為氫釋放的最后限速酶系，產氫細菌的能量代謝直接受其活性的高低以及表達周期的長短影響，并且其活性和表達周期也會間接影響到氫氣的釋放速度和產量［22］。從圖4看出，各實驗組氫化酶活性與產氫量均呈現出一致的先上升后下降的趨勢。在三個實驗組中，實驗前72h左右產氫細菌活躍，具有很強的產氫活性，此時產氫速率也較高，隨后細菌活性逐漸降低，產氫速率也隨之下降，直至細菌衰亡產氫停止。實驗進行至第24h，8%和10%實驗組產氫氫化酶活性均出現最大值，此時產氫速率也最快，分別為43mL／h和81mL／h，這個時候兩個實驗組中的產氫氫化酶均處于最活躍狀態，能夠快速進行代謝產氫。在12%實驗組中，實驗到達第36h時，產氫速率出現峰值為86mL／h，然而此時產氫氫化酶活性沒有出現最大值，而是在第48h出現峰值，可能是因為在第36h時如脫氫酶系等其他與產氫有關的酶系出現且較活躍，共同作用促進氫氣的生成導致在此時出現了最快產氫速率。峰值過后，氫化酶活性衰弱，產氫量也快速下降，當氫化酶基本失活時，產氫量趨于平緩至結束。可以看出，產氫氫化酶的活性一定程度上會影響產氫細菌的代謝和表達，并且有機垃圾發酵液濃度越高，其氫化酶酶活出現峰值的時間會往后有所推移。

圖4 氫化酶活性與產氫量隨時間的變化關系圖Fig 4 Relationship between hydrogenase activity and hydrogen production over time

2.4 pH與氫化酶活性的變化情況

在有機垃圾進行水解酸化的過程中，由于大量有機酸的積累，導致此時體系內pH值不斷下降，影響產氫微生物細胞內氫化酶的活性和代謝途徑等，從而影響產氫菌的產氫能力，當pH值降低至一定程度時，將導致發酵產氫過程的停止。從圖5得出，三個實驗組分別在前72h、72h、96h都由于有機酸的積累導致pH快速下降，當pH下降至過低范圍時，會抑制體系內微生物的作用，從而導致產氣趨于停止，與前面累積產氣量的變化趨勢一致。在pH下降過程中，各實驗組氫化酶活性均呈現出先上升后下降的趨勢。8%實驗組在pH下降至5.5時獲得氫化酶酶活最大值，10%實驗組也是在pH為5.5時獲得了氫化酶酶活最大值，12%實驗組在pH為5.0時獲得了氫化酶酶活的最大值，當pH下降緩慢趨于穩定時，此時酶活也隨之喪失。可以發現，當pH在5～5.5范圍內時，氫化酶活性相對較強，能夠很好的促進產氫細菌的作用，并且，pH過高或過低不僅會影響氫化酶的酶活，降低其產氫能力還會影響整個發酵過程的產氣情況。因此，在利用有機質制氫的過程中，控制其pH范圍極為重要。

圖5 各實驗組氫化酶與pH隨時間的變化Fig 5 Changes of hydrogenase and pH in each experimental group over time

2.5 m（C）／m（N）與氫化酶活性的變化情況

在微生物的生長和代謝過程中，C和N這兩種營養元素起著不可或缺的作用。m（C）／m（N）作為發酵制氫的一個重要參數，能影響有機物在微生物體內的生物氧化過程和通過微生物自身的合成代謝過程進一步導致厭氧微生物細胞內的NADH+H+／NAD+比率和發酵產物數量變化［23］。代謝產物積累、微生物生長、代謝途徑以及酶活性水平等都受m（C）／m（N）的影響。其通過影響氫化酶活性的表達，從而影響產氫能力。m（C）／m（N）與氫化酶活性的變化情況見圖6。

圖6 各實驗組氫化酶與m（C）／m（N）隨時間的變化Fig 6 Changes of hydrogenase and m（C）／m（N）over time in each experimental group

從圖6看出，在8%實驗組中，當m（C）／m（N）值為20時，氫化酶活性最強，10%實驗組中，當m（C）／m（N）值為23時，獲得氫活酶活性最大值，12%實驗組中，當m（C）／m（N）值為21時，獲得氫化酶活性最大值。所以，當m（C）／m（N）范圍在20～25左右時，氫化酶活性相對較強，產氫細菌可以更好的被利用進行代謝制氫。張璐［24］在探究m（C）／m（N）對YUAN-3產氫能力及氫化酶活性的影響實驗研究中發現，隨著m（C）／m（N）比的提高，YUAN-3的氫化酶活性不斷加大，當m（C）／m（N）比為22.4時，YUAN-3獲得最大氫化酶活性，本實驗結論與其一致。

3 結論

1）探究8%、10%、12%三個不同的生活垃圾發酵制氫實驗發現，各實驗組產氫潛力分別為154mL／g、139mL／g、132mL／g，最大產氫速率分別為43mL／h、81mL／h、86mL／h。結合產氫潛力、最大產氫速率、發酵時間考慮，當發酵濃度為8%時，制氫效果最好。產氫過程中液相末端產物主要為乙酸和丁酸，兩者之和占比高達90%以上，發酵類型為典型的丁酸型發酵。

2）氫化酶活性與產氫量有著密切的相關性，當氫化酶活性達到最大值時，產氫速率基本趨于最快。發酵液濃度越高時，其氫化酶酶活出現峰值的時間會往后有所推移。

3）有機垃圾發酵制氫過程中，單獨分析了pH和m（C）／m（N）分別對氫化酶活性的影響發現，當pH在5～5.5范圍內、m（C）／m（N）在20～25范圍內時，氫化酶活性相對較強，能夠很好的促進產氫細菌的作用，進行代謝產氫。為后續研究多因素共同作用對氫化酶活性的影響提供了參考。