脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性研究

翟兆蘭， 呂 仆， 趙 平， 宋湛謙， 商士斌， 饒小平,3*

(1.中國林業科學研究院 林產化學工業研究所；生物質化學利用國家工程實驗室；國家林業和草原局林產化學工程重點實驗室；江蘇省生物質能源與材料重點實驗室；江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京210042； 2.西南林業大學 西南地區林業生物質資源高效利用國家林業局重點實驗室，云南 昆明 650224； 3.中國林業科學研究院 林業新技術研究所，北京 100091)

木材作為一種可再生生物質材料，具有無毒、無污染、美觀、易加工等優點，被廣泛地應用于建筑和裝修等領域。但是木材含有豐富的纖維素，在合適的溫度和濕度下為木材腐朽菌和霉菌的生長提供了養分，導致其很容易受蟲菌侵蝕而腐朽，進而使得木材的使用壽命縮短，造成木材經濟價值和使用價值的嚴重損失[1-3]。因此，木材防腐、防霉技術的研究和開發一直被廣泛關注。目前，雖然防腐效果好的防腐劑種類較多，但通常具有較大的毒性，會造成嚴重的環境污染和安全問題，限制了其應用領域。天然木材防腐劑具有毒性小、污染少、分散均勻、不易流失、可循環利用和防腐抗菌性能良好等優點，因此，天然木材防腐劑研究對提高木材制品的安全性、環保性具有重要意義[4]。

植物次生代謝產物是由植物體內有機化合物的初生代謝途徑衍生而來，是植物在長期進化中與環境相互作用的結果[5]，分為萜類、酚類、含氮化合物、炔類和有機酸類等，可用作殺菌劑、殺蟲劑、抗癌活性成分，對環境和人畜均無害，是一類理想的生物活性產品[6-8]。松香是由松樹樹脂道分泌的松脂經蒸餾得到的二萜類植物次生代謝產物，產量豐富。松香的主要成分樹脂酸含有獨特的三環二萜氫化菲環結構，該結構使得松香具有多個手性中心和良好的生物活性[9-10]。并且松香樹脂酸含有雙鍵和羧基2種官能團，易于進行化學改性，可制備多種不同生物活性的松香衍生物[11-12]。Li等[13]以松香、丙烯酸和二乙烯三胺為原料合成松香基酰胺，當其質量濃度為64 g/L時，即可對彩絨革蓋菌實現Ⅰ級防腐(木材質量損失率<10%)；質量濃度為32 g/L時，對密粘褶菌實現Ⅰ級防腐。Chen等[14]以松香、富馬酸、環氧氯丙烷和三乙胺為原料合成松香季銨鹽化合物，其對變色栓菌、白腐真菌和白茅內生菌均有良好的抑菌效果。Lin等[15]合成的馬來松香基二硫脲化合物，對蘋果輪紋病菌的最高抑制率為66.9%。Chen等[16]以脫氫樅酸為原料合成了16種新型噻唑烷酮類化合物，當質量濃度為0.05 g/L時，部分化合物對玉米赤霉菌的抑制率達91.3%，表現出顯著的抑菌活性，與商業抑菌藥物嘧菌酯效果相當。不同類型的松香衍生物對木材腐朽真菌及植物病原真菌均表現出較好的抑菌活性，但大多研究報道停留在衍生物的抑菌性能篩選，對結構與性能的關系分析較少。本研究探討了松香改性產物脫氫樅酸、脫氫樅胺、脫氫樅酸酰胺衍生物和脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對6種會引起霉變或腐變的不同植物病原真菌的抑菌活性，探索化合物結構的改變對抑菌性能的影響，進一步研究了時間和質量濃度對抑菌活性的影響，以期篩選出抑菌活性高的松香衍生物。

1 實 驗

1.1 材料、試劑與儀器

脫氫樅酸(1)、脫氫樅胺(2)、脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)和脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)，自制，根據文獻[17]的方法合成及提純，結構式如圖1所示?；移咸焰?Botrytiscinerea) CGMCC 3.3790、腐皮鐮孢(Fusariumsolani) CGMCC 3.2889、禾谷鐮孢 (Fusariumgraminearum) CGMCC 3.4733、尖孢鐮孢(Fusariumoxysporum) CGMCC 3.3633、蕓苔鏈格孢(Alternariabrassicae) CGMCC 3.7805和采絨革蓋菌 (Coriolusversicolor) CFCC 5336這6種供試植物病原真菌由中國普通微生物菌種保藏管理中心和中國林業微生物菌種保藏管理中心提供。無水乙醇、葡萄糖、瓊脂和放線菌酮，均為分析純；蒸餾水、75%消毒酒精和95%酒精，實驗室自制。

圖1 脫氫樅酸和脫氫樅基含氮衍生物的分子結構示意圖Fig.1 Molecular structure of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives

SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；HVE-50高壓滅菌鍋，華粵行儀器有限公司； LG-520(D)醫藥專用柜，浙江華美電器制造有限公司；PQX-380D多段可編程人工氣候箱，寧波東南儀器有限公司。

1.2 馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基的制備

準確稱取馬鈴薯200 g，洗凈削皮，切成小塊。電磁爐將蒸餾水加熱至100 ℃，加入準備好的馬鈴薯并不斷攪拌，防止粘鍋，待馬鈴薯煮至用水輕壓易碎，濾除馬鈴薯殘渣。將鍋洗凈，將馬鈴薯濾液倒入鍋中，并用小火加熱至沸騰，緩慢加入20 g葡萄糖，攪拌至葡萄糖完全溶解，再緩慢加入18 g瓊脂，快速攪拌，防止粘鍋，減小火力，待液體澄清透明，關火，冷卻至室溫，即得馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基。將制備好的PDA培養基倒入量杯中，最終倒入備好的錐形瓶中，密封瓶口。

1.3 病原真菌活化

將洗凈的培養皿、接種針和PDA培養基放入高壓滅菌鍋中，0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌22 min，將滅菌后的培養基及器具放入超凈工作臺，紫外燈照射15 min，關閉紫外燈，吹風10 min；將未凝固的培養基傾倒至空皿，每皿倒入約20 mL，放平，待完全冷凝。用接種針將保存于試管中的病原真菌菌絲挑出，采用劃線法將菌絲接種于上述培養基平板上，不要劃破瓊脂，接種完成后用封口膜將皿口密封以防止外部污染進入；標記接種菌的名稱和日期，將接種完畢的真菌平板放入28 ℃恒溫培養箱，避光培養至有明顯菌落。

1.4 抑菌活性測定

1.4.1初步測定 采用生長速率法測定樣品溶液對病原真菌的抑制活性。準確稱取36 mg樣品，用無水乙醇定容至10 mL，配制質量濃度為3.6 g/L的待測樣液。在超凈工作臺中，用滅菌槍頭移取9 mL待測樣液，用0.22 μm無菌濾頭過濾后與171 mL、40 ℃的PDA培養基輕搖混和均勻。每個培養皿中倒入含樣品的PDA培養基10 mL，設置每個培養皿中樣品的最終質量濃度為180 mg/L，轉動培養皿使培養基均勻平鋪，標記，冷卻凝固備用。

以無水乙醇為溶劑對照，以與待測液相同質量濃度的放線菌酮水溶液為陽性對照，以純PDA培養基為空白對照，每個樣品設置3組平行實驗。溶劑對照與陽性對照同上操作。

接種已活化好的病原真菌，所有病原真菌在同一天內接種完畢。接種完畢放入培養箱培養3～10 d，培養至第2、 4、 6、 8、 10 d時，用十字交叉法測量病原真菌的菌落生長直徑，并記錄數據，抑制率計算公式如下：

式中：I—抑制率，%；D0—空白對照組平均直徑，mm；Ds—處理組平均直徑，mm。

1.4.2活性較好樣品的進一步測定 根據初步測定的結果，對活性較好的樣品進行進一步抑菌活性測定。采用二倍稀釋法制備樣品的最終質量濃度分別為90、 45、 22.5、 11.25 mg/L，同樣以無水乙醇為溶劑對照，以與待測液相同質量濃度的放線菌酮水溶液為陽性對照，以純PDA培養基為空白對照。同一個樣品在一個質量濃度梯度下分別接種灰葡萄孢、采絨革蓋菌、腐皮鐮孢、尖孢鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢6種病原真菌，每個實驗設置3個重復組，在28 ℃的培養箱中培養10 d，期間測量每種菌的生長直徑，計算平均直徑和抑制率。

2 結果與分析

2.1 不同類型脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性

2.1.1初步測定結果 化合物1、2、3a～3m和4a～4i對不同病原真菌的抑制活性如表1所示。

由表1可知，脫氫樅酸(1)僅對蕓苔鏈格孢的抑制率大于60%，對灰葡萄孢的抑制率大于40%，而對其他4種病原真菌的抑制率均小于40%。脫氫樅胺(2)對灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制率均大于65%，并且脫氫樅胺對6種病原真菌的抑制率均大于脫氫樅酸，表明脫氫樅胺具有較好的抑菌活性，且遠遠好于脫氫樅酸。脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)對6種病原真菌的抑制率均較低，僅脫氫樅酸酰胺(3a)對蕓苔鏈格孢的抑制率大于80%，3j對灰葡萄孢的抑制率大于90%。說明脫氫樅酸酰胺衍生物對6種病原真菌的抑制活性較低。脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)中的每個樣品至少對2種病原真菌的抑制率能達70%以上，并且其中4d對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，4h對灰葡萄孢、腐皮鐮孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，與陽性對照放線菌酮的抑制活性相當。上述結果表明脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對6種病原真菌具有較好的抑菌活性，且遠遠優于脫氫樅酸酰胺衍生物。因此后續實驗選用抑菌活性較好的4a～4i對6種不同病原真菌的抑制活性進一步分析。

表1 脫氫樅酸和脫氫樅基含氮衍生物的抑菌活性(培養2天)Table 1 Antibacterial activities of dehydroabietic acid and dehydroabietyl nitrogen derivatives (cultivated 2 d)

2.1.2化合物4a～4i的抑菌活性 化合物4a對灰葡萄孢的抑制率大于90%，對禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制率大于80%，但對采絨革蓋菌的抑制率較差，小于20%。對比化合物4a，在苯環的對位引入甲氧基、氟原子和氯原子的4b、4g和4h對灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢(4g除外)的抑制率均大于80%，具有突出的抑菌活性。此外，化合物4b、4g和4h對采絨革蓋菌的抑制率對比化合物4a均有較大的提高，表明在苯環的對位引入甲氧基、氟原子和氯原子增加了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。對比化合物4g，化合物4f對灰葡萄孢和禾谷鐮孢同樣有較好的抑制活性，抑制率大于90%，但對腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢和尖孢鐮孢的抑制活性較差，表明脫氫樅胺(對氟)苯甲醛Schiff堿的抑菌活性比脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿的好。脫氫樅胺水楊醛Schiff堿(4c)對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率大于90%，脫氫樅胺(對氯)水楊醛Schiff堿(4d)對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率均為100%，與放線菌酮對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制活性相當，同樣表明氯原子的引入增加了脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。此外，化合物4d對采絨革蓋菌具有較好的抑制活性，抑制率均大于80%。綜上所述，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物苯環的對位被氯原子取代的化合物4d和4h對6種病原真菌抑制活性最好，對位被氟原子和甲氧基取代的化合物4g和4b次之，在間位被氟原子取代的化合物4f的抑菌效果也較好，說明含有鹵素原子取代的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物對6種病原真菌具有突出的抑制活性。

2.2 時間對脫氫樅基含氮衍生物抑菌活性的影響

選取對6種病原真菌具有較好抑制活性的含鹵素的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物，脫氫樅胺(對氯)水楊醛Schiff堿(4d)、脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿(4f)、脫氫樅胺(對氟)苯甲醛Schiff堿(4g)和脫氫樅胺(對氯)苯甲醛Schiff堿(4h)，測定了其質量濃度為180 mg/L時在不同時間下對6種病原真菌的抑制活性，結果如圖2所示。

a.4d； b.4f； c.4g; d.4h圖2 脫氫樅基含氮衍生物在不同時間下的抑菌活性Fig.2 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different time

化合物4d對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢在不同時間內均具有突出的抑制活性，抑制率為100%，對腐皮鐮孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性隨時間的增加而降低，2天時的抑制活性最高，對采絨革蓋菌的抑制活性隨時間的增加先升高后降低，第4天時的抑制活性最好?；衔?f對灰葡萄孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性均隨時間的增加而降低，對腐皮鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性隨時間的增加先升高后降低?；衔?g對灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢和禾谷鐮孢的抑制活性受時間的影響較小，在測試時間內抑制率均大于80%，4g對尖孢鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性均隨時間的增加而升高，第10天時的抑制活性最好?；衔?h對灰葡萄孢、腐皮鐮孢、蕓苔鏈格孢、禾谷鐮孢和尖孢鐮孢的抑制活性在測試時間內變化較小，抑制率均大于80%，對采絨革蓋菌的抑制活性隨時間的增加先增加后趨于不變。

2.3 質量濃度對脫氫樅基含氮衍生物抑菌活性的影響

研究了化合物4d、4f、4g和4h10天時在不同質量濃度下對6種病原真菌的抑制活性，結果見圖3。由圖可知不同質量濃度的4f、4g和4h對灰葡萄孢的抑菌率均大于95.00%，具有突出的抑制活性，抑制活性受質量濃度的影響較小，但是質量濃度對4d對灰葡萄孢的抑菌活性影響較大，11.25和45 mg/L時的抑制率為100.00%，22.5 mg/L時的抑制率僅為52.00%。4種樣品對尖孢鐮孢均具有較好的抑制活性，抑制活性受質量濃度的影響較小，不同質量濃度下的抑制率均大于70%，而對腐皮鐮孢、禾谷鐮孢、尖孢鐮孢和采絨革蓋菌的抑制活性受質量濃度的影響較大。整體上，化合物4d對6種病原真菌的抑制活性最差，這可能是因為4d的苯環上還含有羥基，羥基的引入降低了含鹵原子的脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物的抑菌活性。并且，4d對6種病原真菌的抑制率隨質量濃度的變化趨勢不一致，受質量濃度的影響較大，但均在11.25 mg/L的抑制率較高。化合物4f、4g和4h對不同的植物病原真菌的抑制率隨質量濃度的變化趨勢一致，4f在22.5 mg/L對6種病原真菌的抑制率最高，并且均大于95%，表明4f在22.5 mg/L時具有突出的抑菌性。而4g對6種病原真菌的抑制率隨質量濃度的增加先降低后增加，在22.5 mg/L時抑制率最低，在其他質量濃度下有較好的抑制活性(抑制率大于70%)。4h對6種病原真菌的抑制率隨質量濃度的增加先降低后增加再降低，在45 mg/L時的抑制率較高。上述結果表明鹵原子的取代位置和類型均影響脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物在不同質量濃度下的抑菌活性和最佳抑制活性的質量濃度。

a.灰葡萄孢B. cinerea; b.腐皮鐮孢F. solani; c.禾谷鐮孢F. graminearum; d. 尖孢鐮孢F. oxysporum;e.蕓苔鏈格孢A. brassicae; f. 采絨革蓋菌C. versicolor圖3 脫氫樅基含氮衍生物在不同質量濃度下的抑菌活性Fig.3 Inhibitory activity of dehydroabietyl nitrogen derivatives at different mass concentrations

3 結 論

3.1采用平板計數法研究了脫氫樅酸和23種脫氫樅基含氮衍生物對6種病原真菌的抑菌活性，結果表明：脫氫樅胺的抑菌活性遠遠好于脫氫樅酸，脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物(4a～4i)的抑菌活性遠遠優于脫氫樅酸酰胺衍生物(3a～3m)。在脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物苯環上引入鹵素原子較強地增加了其抑菌活性。當質量濃度為180 mg/L時，脫氫樅胺(對氯)水楊醛Schiff堿(4d)對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢的抑制率均為100%，脫氫樅胺(對氯)苯甲醛Schiff堿(4h)對灰葡萄孢、腐皮鐮孢和蕓苔鏈格孢的抑制率為100%，脫氫樅胺(間氟)苯甲醛Schiff堿(4f)和脫氫樅胺(對氟)苯甲醛Schiff堿(4g)在不同培養時間對部分病原真菌的抑制率也達到100%，與陽性對照物放線菌酮的抑制活性相當。

3.2進一步研究了化合物4d、4f、4g和4h在不同質量濃度下對6種病原真菌的抑菌活性。結果表明：4種化合物在不同質量濃度下對灰葡萄孢和蕓苔鏈格孢具有較好的抑制活性，大于70%(4d在22.5 mg/L時除外)。苯環上鹵原子的取代位置和類型均會影響脫氫樅胺(取代)苯甲醛Schiff堿衍生物在不同質量濃度下的抑菌活性和最佳抑菌活性的質量濃度。