siRNA下調AEG-1對大腸癌細胞體內成瘤影響的研究

黃素軍 宋華鋒 楊綺紅 黎銘恩 羅國彪

【關鍵詞】星形膠質細胞升高基因-1;小干擾核糖核酸;結直腸癌;體內成瘤

結直腸癌是威脅全球人類健康的最常見的惡性腫瘤之一。據統計，2017年全球結直腸癌新發病例約為183萬例，中國大陸地區新發病例約為43萬例，我國發病數在28年間增長了203.5%，已躍居我國惡性腫瘤的第4位[1]。

星形膠質細胞升高基因-1（AEG-1）是2005年Kang等[2]采用快速消減雜交的方法首次克隆出來的癌基因，位于人染色體8q22，該區域是多種惡性腫瘤高度相關地帶。AEG-1在人體多種惡性腫瘤中的表達升高，在腫瘤發生中發揮著關鍵的致癌作用。AEG-1在結直腸癌中的蛋白表達水平明顯升高，而且在正常黏膜、低級別腺瘤、高級別腺瘤和大腸癌中的表達依次升高[3-4]。

我們既往的研究顯示AEG-1在結直腸癌細胞株HCT116中高表達，且在體外研究發現下調AEG-1表達會抑制結腸癌細胞增殖、克隆形成和侵襲能力，促進凋亡，增加對5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性，但體內實驗是否會有肯定的結果尚待進一步研究[5-6]。為此，我們通過慢病毒介導的小干擾RNA（siRNA）技術干擾AEG-1表達構建結直腸癌穩定細胞株后進行裸鼠成瘤實驗。

材料與方法

一、材料及主要試劑

采用AEG-1siRNA病毒載體，含綠色熒光蛋白（GFP）基因（psPAX，pMD2.G慢病毒包裝系統，Invitrogen公司）;結腸癌HCT116細胞株（購自中國模式培養物集庫存，中國北京）;免疫缺陷小鼠（購自中山大學實驗動物中心）。Trizol試劑（Invitrogen公司）;RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit（#K1621，#1622，Fermentas公司）、SYBRPremixExTaqII（TliRNaseHPlus）（DRR820）購自TaKaRa公司;RIPA細胞裂解液和蛋白酶抑制劑（PMSF，廣州博彩生物公司）;NovexECL發光試劑盒（WP20005，Invitrogen公司）;兔抗人AEG-1抗體;兔抗人GAPDH抗體（Invitrogen公司）。

二、方法

1. 慢病毒介導干擾AEG-1-siRNA穩定細胞株構建

采用化學合成方法合成以AEG-1為靶點的RNA干擾序列（AEG-1-RNAi1，s：GCAGCAAGGCAGTCTTTAAGT，as：ACTTAAAGACTGCCTTGCTGC），挑選了帶GFP報告基因的慢病毒載體（RNAil組）和空載體（空載組），采用psPAX，pMD2.G慢病毒包裝系統，轉染成功后收取上清（病毒液），病毒感染結腸癌細胞株HCT116（HCT116對照組），轉染48h后，采用0.5μg/ml嘌呤霉素的10%胎牛血清DMEM培養基篩選出陽性細胞。

2. 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測AEG-1mRNA的表達

采用Trizol試劑提取細胞的總RNA，以OligodT為引物逆轉錄成cDNA，逆轉錄條件為：65℃5min，42℃60min，70℃5min。在ABIPRISM7500qRT-PCR儀上按照兩步法進行擴增，使用β-actin作為內參，計算△CT值（△CT=CT目的-CT內參）和2﹣△CT。

3. 蛋白質印跡法檢測AEG-1蛋白表達

采用RIPA裂解細胞，收集上清，定量，取50μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳，采用PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫下封閉1h后，分別加入兔抗人AEG-1抗體（Invitrogen）1∶1000和兔抗人GAPDH抗體1∶1000，4℃過夜，TBST洗滌，加入相對應的二抗，室溫孵育1h，TBST洗滌，ECL顯色試劑盒顯影，以GAPDH為內參。

4. 裸鼠體內成瘤試驗

將14只裸鼠隨機分成2組即HCT116-control組和HCT116-RNAi1組，分別采用轉染前后細胞株接種，將濃度為1×106個/ml的細胞懸液注射到裸鼠背部，每只0.2ml，同樣條件下飼養，每周測量接種部位瘤體的最長直徑a（mm）和最短直徑b（mm），瘤體體積=a×b2/2（mm3）。4周后處死小鼠取出瘤體測量質量。

三、統計學處理

采用SPSS13.0進行統計分析。正態分布數據以表示，2組間比較采用t檢驗或者t'檢驗，重復測量資料采用重復測量資料方差分析，交互效應有意義時采用t檢驗分析單獨效應，α=0.05，兩兩比較采用Bonferroni法校正檢驗水準。

結果

一、成功構建AEG-1-RNAi結直腸癌穩定細胞株

成功構建攜帶siRNA和GFP基因慢病毒載體，用其轉染結腸癌細胞株HCT116，48h后于倒置熒光顯微鏡下觀察可見綠色熒光（如圖1），結果可見HCT116細胞被攜帶siRNA和GFP的慢病毒高效率轉染，轉染率大于95%。

二、qRT-PCR和蛋白免疫印跡法檢測AEG-1的干擾效果

采用RNAi1干擾后AEG-1的mRNA（t=12.382，P=0.006）和蛋白（P<0.001）表達水平明顯降低，siRNA能顯著下調AEG-1的表達，表明成功建立低表達AEG-1的結腸癌細胞模型HCT116，見圖2。

三、AEG-1對體內結腸癌細胞腫瘤發生的影響

第1周HCT116對照組處理的裸鼠已有明顯的腫瘤形成（20.41±2.63）mm3，而注射AEG-1-RNAi處理的小鼠第1周腫瘤沒有生長，隨后2、3、4周瘤體體積分別為（10.43±3.30）、（22.31±4.55）、（47.54±10.13）mm3，對照組為（35.14±7.29）、（66.39±18.86）、（94.53±27.31）mm3（圖3A），重復測量資料方差分析顯示2組瘤體體積隨時間變化的趨勢不同，差異有統計學意義（F=3.714，P=0.025），因此分析單獨效應。2組第2（t=-6.906，P=0.001）、3（t=-5.080，P=0.001）、4（t=-3.608，P=0.007）周瘤體體積比較差異均有統計學意義。4周后處死裸鼠，取出瘤體測量質量，處理組為（0.013±0.002）g，低于對照組的（0.039±0.016）g（t=-3.535，P=0.023，圖3B）。

討論

AEG-1是一個多功能的癌基因，它可以調節致癌轉化，提高惡性腫瘤的侵襲性，促進腫瘤增殖、擴散、轉移，誘導新生血管形成以及介導化學治療藥物耐藥等[7]。在卵巢癌中，敲除AEG-1可以抑制癌細胞的遷移和侵襲[8]。AEG-1還與腫瘤的臨床分期、組織分化、淋巴結轉移和預后不良密切相關。AEG-1的高表達與總體生存率低相關，高表達的總生存時間明顯短于低表達，其可能是腫瘤的早期預警和患者生存的獨立預后指標[3，9-10]。在不同級別星形細胞瘤中，AEG-1陽性率隨腫瘤惡性程度的增加而增高，表達強度與腫瘤的級別呈正相關，與生存率呈負相關[11]。

大腸癌的演變是一個涉及多基因變化的復雜的過程，由正常腸上皮轉化為腸上皮化生、腺瘤、腺瘤伴不典型增生、上皮內瘤變、癌，整個過程可能與多個癌基因、抑癌基因以及多條腫瘤信號通路的變化有關。近年來發現AEG-1不僅是各器官和組織致癌過程中的關鍵因素，而且是復雜的腫瘤信號通路網中的關鍵交匯點，其可以作用于多條信號通路，包括激活核因子-κB、Ha-Ras和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（Akt）通路、ERK/MAPK和Wnt/β-catenin通路，還有Aurora-Akinas信號通路等[12-13]。在非小細胞肺癌中，AEG-1通過提高抗凋亡蛋白Bcl-2水平和激活PI3K/Akt途徑抑制細胞凋亡[9]。在結直腸癌中，AEG-1通過影響β-catenin增強結直腸癌細胞的轉移和侵襲能力[13]。

我們前期研究以AEG-1基因為靶點，采用siRNA可以有效抑制AEG-1的表達，通過MTT、平板克隆、transwell和流式細胞儀等方法發現在體外下調AEG-1表達會抑制結腸癌細胞的增殖、克隆形成和侵襲能力，導致細胞周期G0/G1期停滯，促進凋亡和增加5-FU細胞毒性，以及影響血管生成相關因子缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）的產生[5-6，14]。然而，干擾AEG-1的表達在體內試驗會有怎樣的結果及其相關的信號通路，我們仍然不清楚。因此我們深入研究，進一步進行裸鼠體內成瘤實驗。實驗結果顯示，沉默AEG-1可抑制結腸癌細胞在裸鼠體內成瘤的能力，抑制腫瘤的生長，可見AEG-1在結直腸癌的癌變過程中起著重要的作用，有望成為腫瘤基因治療的新靶點和預后評估指標。

惡性腫瘤具有無限生長潛力，與它可以誘導血管生成是密切相關的，而AEG-1可以誘導新生血管生成及促進血管生成相關因子的產生。有學者報道AEG-1肝細胞的條件培養基可以誘導顯著的血管生成;在宮頸癌中沉默AEG-1可以顯著下調血管生成相關因子HIF-1α、Tie2、血管內皮生長因子（VEGF）和TEM1/CD248的表達，而且人臍靜脈內皮細胞在SiHa細胞或轉染AEG-1的正常宮頸上皮細胞的條件培養基下培養，其血管生成能力增強[15-16]。另也有報道AEG-1與微小RNA（miRNA）關系密切，AEG-1通過介導miRNA-154表達抑制胃癌細胞的增殖，miRNA-564直接作用于AEG-1抑制甲狀腺乳頭狀癌的侵襲性，miRNA-504通過作用于AEG-1抑制視網膜母細胞瘤細胞的增殖和侵襲能力[17-19]。我們前期研究發現通過上調或下調AEG-1表達會改變miRNA的表達譜，推測AEG-1可能是通過改變某些miRNA的表達，從而影響血管生成相關因子的產生[5，14]。前期研究顯示上調AEG-1的表達會抑制miRNA-34a和促進HIF-1α的表達[14]。miRNA-34a是一個抑癌基因，高表達的miRNA-34a可抑制沉默信息調節因子1、損害內皮組細胞以及阻斷VEGF的產物，從而抑制血管新生;而HIF-1α能使細胞更容易適應低氧的環境，是細胞對缺氧反應的最重要調節者，可以促進癌細胞表達VEGF，促進血管生成。有研究發現敲除miRNA-34a可通過激活Notch/HIF-1α信號通路，從而顯著提高肝切除后10d大鼠肝功能和肝細胞再生能力[20]。也有報道指出miRNA-34a通過負性調節SIRT1/HIF-1α信號來影響2型糖尿病相關耳蝸毛細胞的凋亡[21]。這與我們在結直腸癌中發現下調AEG-1的表達會促進miRNA-34a及抑制HIF-1α表達是一致的。因此我們推測在結直腸癌中，AEG-1可能通過抑制miRNA-34a促進HIF-1α的表達，從而促進VEGF的表達，發揮促進腫瘤血管新生的作用。

綜上所述，沉默AEG-1可以抑制結直腸癌細胞的體內成瘤能力，其機制可能與通過調節miRNA從而影響血管生成相關因子的產生有關，這將為進一步研究結直腸癌中AEG-1基因治療奠定基礎。