BACH1在胃癌中的表達及其臨床意義

陳 沖，周 波，常家聰

胃癌作為全球第五大高發癌癥，死亡率位居第三，目前患者的5年生存率依然低下[1]。因此，進一步研究胃癌分子機制并為之提供合理的治療方案迫在眉睫。當前發現轉錄因子BACH1(BTB and CNC homology1)是一種轉錄抑制因子，屬于帽和衣領堿性區域亮氨酸拉鏈蛋白家族(cap'n'collar type of basic region leucine zipper protein family，CNC-bZip)，它通過抑制血紅素環氧化酶1(hemoxygenas-1，HO-1)的表達在調節氧化應激中起重要作用[2]，越來越多的證據表明BACH1參與結腸癌、乳腺癌、肺癌等癌癥的發生、發展[3-5]。然而國內外尚未發現BACH1在胃癌組織中的表達情況及其與臨床病理資料相關性的文獻報道，因此該研究通過檢測BACH1在胃癌組織中的表達情況，分析其與臨床病理特征和預后的相關性，為進一步研究其在胃癌發生、發展中的作用機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1胃癌組織芯片及相關信息 胃癌組織芯片(型號：HStmA180Su15)購自上海芯超生物科技有限公司,包含了手術時間為2006年7月～2007年4月共98例胃癌患者癌組織及與其相對應的82例癌旁組織，經后期實驗觀察排除取材失敗位點，最終納入統計的為89例胃癌組織和78例癌旁組織，其中癌與癌旁配對共70例。組織芯片制作流程: 在組織數據庫中選擇合適的組織病例編號，按照組織病例編號從組織庫中取出組織蠟塊和對應的HE染色切片，用組織陣列儀按照陣列設計抽提病理蠟塊組織芯并有規律的排列在空白受體蠟塊上，用全自動組織切片機曝露組織芯后對組織陣列塊進行切片，切片裱附在防脫片處理的載玻片上最終形成胃癌組織芯片。胃癌患者年齡：41～84(64.74±10.015)歲。胃癌患者的隨訪情況:采取電話隨訪形式，隨訪截止時間為2015年7月，隨訪時間為1個月～107個月，中位隨訪時間43個月。所有患者術前均未接受放化療治療。

1.1.2試劑 兔抗人BACH1單克隆抗體(DF8317；1 ∶ 200)、SP染色試劑盒、DAB顯色試劑盒、蘇木精染色劑購自合肥摩爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 將組織芯片置于恒溫箱中烘烤脫蠟后置于二甲苯中脫蠟2次；酒精梯度脫水；抗原修復；阻斷過氧化物酶;山羊血清室溫封閉；封一抗、封HRP標記二抗, DAB顯色；蘇木精復染；自來水分化；中性樹脂封片； 顯微鏡觀察。

1.2.2結果判讀 由2名經驗豐富的病理科醫師通過雙盲法對免疫組化結果閱片并評分。采取雙評分半定量法評估BACH1的表達情況，免疫組化結果評分=著色程度×陽性細胞百分率，按以下評估標準進行結果判讀，陽性細胞：≤5%計0分；6%～25%計1分；26%～50%計2分；51%～75%計3分；≥75%計4分，最終評分<4分為陰性表達，≥4分為陽性表達。著色強度：無陽性染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，3褐色計3分。最高分12分，4分及以下為低表達，5分及以上為高表達[6]。

1.3 統計學處理采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，使用卡方檢驗或Fisher確切概率法進行組間比較，使用Kaplan-Meier法進行單因素分析并繪制生存曲線, 生存率的比較采用Log-rank檢驗, 預后評估運用COX風險比例模型。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 BACH1在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達情況BACH1集中表達在細胞核和細胞質中，鏡下觀察為淺黃色至棕黃色沉淀。BACH1在胃癌組織中呈中度表達或低表達，在癌旁正常組織中呈低表達或不表達，見圖1，胃癌組BACH1表達陽性率顯著高于癌旁組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

圖1 BACH1在胃癌組織和癌旁組織中的表達情況 ×200

表1 胃癌和癌旁組織中BACH1的表達情況(n)

2.2 BACH1的表達與胃癌臨床病理特征的關系BACH1的表達和胃癌的病理分級(P=0.017)、T分期(P=0.038)、淋巴結轉移(P=0.035)和TNM分期(P=0.007)相關，而和性別、年齡、腫瘤大小及遠處轉移無明顯相關性，見表2。

表2 BACH1表達水平與胃癌臨床病理特征的相關性(n)

2.3 BACH1表達與胃癌預后的相關性分析使用Kaplan-Meier生存分析法和Log-rank統計檢驗分析BACH1表達和胃癌患者預后的相關性并繪制生存曲線圖，結果顯示BACH1高表達患者預后更差(P=0.014),見圖2，然后使用單因素COX風險比例模型進行生存分析，結果顯示淋巴結轉移(P=0.045)、遠處轉移(P<0.001)、TNM分期(P=0.019)及BACH1表達(P=0.016)可作為胃癌患者預后的預測因子,隨即將上述4個指標納入多因素COX風險比例模型分析進行生存分析，結果顯示BACH1表達(P=0.028)和遠處轉移(P=0.001)是胃癌不良預后的獨立危險因素。見表3。

3 討論

本研究通過組織芯片技術，用免疫組化實驗方法檢測胃癌組織 中BACH1的 表達情況，結果顯示其在胃癌組織中的表達高于癌旁正常組織，并證實其與胃癌病理分級、T分期、淋巴結轉移及TNM分期顯著相關。為了了解BACH1表達高低與胃癌患者預后的關系，通過Kaplan-Meier單因素生存分析發現BACH1高表達胃癌患者預后較低表達更差；通過單因素COX風險比例模型分析發現BACH1表達、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM分期均是患者預后的危險因素，將上述4個指標納入多因素COX風險比例模型分析發現BACH1表達和遠處轉移是胃癌患者預后的獨立危險因素。綜合上述結果考慮BACH1可能參與了胃癌的發生、發展并與不良預后相關。

表3 影響胃癌患者預后的單因素和多因素COX風險比例模型分析

圖2 胃癌患者BACH1表達的Kaplan-Meier生存曲線

細胞衰老是抑制突變細胞增殖的關鍵，可抑制腫瘤的發生, p53作為人類癌癥中最常見的抑癌基因之一，其突變引起的編碼蛋白構象改變和功能喪失最終會導致腫瘤的發生[7-8]。當前研究發現轉錄因子BACH1是氧化應激反應的關鍵負調控因子，其通過抑制血紅素氧合酶1(hemoxygenas-1，HO-1)基因的表達來增加氧化應激，BACH1在p53靶基因的一個子集上通過招募組蛋白去乙酰化酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)后與p53形成復合物，從而抑制p53的轉錄活性，進而抑制氧化應激情況下由p53介導的細胞衰老的過程，因此BACH1作為p53的負調控因子，連接了氧代謝和細胞衰老[9-11]。有學者證實BACH1可過表達競爭性結合p53從而阻礙其發揮正常生物學效應使得膠質母細胞瘤獲得耐藥性[12]。研究[4]表明BACH1轉錄調節多個參與乳腺癌骨轉移的基因，可以顯著促進乳腺癌細胞的侵襲轉移。最新研究[5]發現BACH1可以通過刺激糖酵解的方式促進肺癌細胞糖酵解依賴性轉移。以上研究發現提示BACH1可能通過抑制相關抑癌基因如p53等和相關抗氧化應激反應基因如HO-1等基因的生物學活性破壞胃上皮細胞原有的氧化應激、衰老、凋亡機制的平衡，轉錄調節促胃癌轉移基因，刺激胃癌細胞活性等機制參與胃癌的發生、發展。

綜上所述，該研究揭示了BACH1表達水平與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系，表明其可能促進癌癥的發生、發展并具有獨立的預后意義，因此其有望成為胃癌患者預后的潛在生物標志物，然而BACH1在胃癌的發生發展中的具體機制還不清楚，需要通過進一步的實驗加以研究。該研究存在了一些不足之處，包括樣本量太少、無新鮮胃癌標本進行驗證、缺乏細胞水平和動物水平實驗驗證等問題，這正是課題組后期準備開展的工作。