利尿合劑的質量標準分析

陳向英 楊志華 洪美華

廣東省中山市中醫院藥學部，廣東中山 528401

利尿合劑為本醫院中藥自制制劑（批號文號：粵藥制字Z20071008），是本院臨床治療泌尿系感染常規用藥。由葉下珠、白花蛇舌草、海金沙、一點紅、金砂藤、甘草等藥味組成，具有清熱祛濕、解毒通淋的作用，臨床用于泌尿系感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利等癥[1]，為了控制利尿合劑的質量，本研究采用薄層色譜法對制劑中的白花蛇舌草、葉下珠進行了定性鑒別，同時采用高效液相色譜法對制劑中甘草酸進行了含量測定，結果表明，該實驗方法簡便，準確，重現性好，能有效控制利尿合劑的質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 高效液相色譜儀；電子天平（BS224S，Sartorius）；超聲波清洗劑（KQ5200E，昆山市超聲儀器有限公司）；薄層色譜攝影儀（Good see-I，上海科哲生化科技有限公司）；硅膠G 板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

利尿合劑（中山市中醫院制劑室提供，每瓶100ml，樣品批號：20191107，20191122，20191211）；白花蛇舌草（批號：121183-201404）、葉下珠（批號：121563-201805）、熊果酸（批號：110748-201706），對照藥材與對照品均購于中國藥品生物制品檢定所；甘草酸（日本松浦藥業株式會社）。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 白花蛇舌草 取供試品利尿合劑40mL，蒸干，殘渣加乙醇10mL 使溶解，作為供試品溶液。另取白花蛇舌草對照藥材1g，加乙醇10mL，超聲處理30min，趁熱濾過，濾液蒸干，殘渣加乙醇1mL 使溶解，作為對照藥材溶液。再取熊果酸對照品，加乙醇制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作為對照品溶液。陰性樣品按供試品同法處理，制成陰性供試液，照薄層色譜法（中國藥典一部附錄Ⅵ B）試驗，吸取上述四種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～ 60℃）- 苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相對應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性無干擾。見圖1。

圖1 （T ：28℃，RH ：65%）

圖2 （T ：28℃，RH ：65%）

2.1.2 葉下珠 取供試品利尿合劑20mL，加乙酸乙酯30mL 振搖提取，蒸干，殘渣加甲醇1mL 使溶解，作為供試品溶液。另取葉下珠對照藥材2g，加水煎煮30min，濾過，濾液濃縮至約20mL，同法制成對照藥材溶液。再取陰性樣品20mL，同法制成陰性對照溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版一部附錄）試驗，吸取上述三種溶液各10μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以石油醚（30 ～60℃）-苯 - 乙酸乙酯 - 冰醋酸（20 ∶ 40 ∶ 14 ∶ 1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，對照色譜則無此斑點。并經28℃，相對濕度（RH）35%，65%，88%；8℃下RH60% 等條件下的方法學考察，均顯示出穩定的結果。見圖2。

3 含量測定

3.1 色譜條件

色譜柱為Agilent ZORBAX XDB-C18柱（4.6mm×250mm 5μm）；流動相為甲醇-0.2mol/L 醋酸銨溶液- 冰醋酸（55 ∶45 ∶1）梯度洗脫；檢測波長：250nm；流速：1.00mL/min；柱溫：40℃；進樣量為20μL。

3.2 對照品溶液的制備

精密稱取甘草酸對照品5.406mg 置于50mL 量瓶中，加50% 甲醇至刻度作為甘草酸對照品溶液儲備液，稱取3mL 儲備液加入10mL 容量瓶，加50%甲醇稀釋至刻度作為對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

取利尿合劑30mL，精密加入流動相50mL，混合均勻，超聲處理10min，放冷，用流動相補足溶劑量，搖勻，過濾，取濾液20mL，作為供試品溶液。

3.4 陰性對照品溶液的制備

按處方中藥味除去甘草，其余藥味按成方的生產工藝及供試品溶液的制備方法，作為陰性對照品溶液。

3.5 線性關系考察

精密吸取甘草酸對照品溶液儲備液1、2、3、4、5mL，分別置10mL 容量瓶中，加50% 甲醇至刻度，搖勻，分別進樣（采用20μL 進樣環滿刻度進樣），按上述條件測定。計算回歸方程得：Y=419503.8X-6314，r=0.9997，甘草酸在 0.2162 ～ 1.081μg 范圍內，呈良好的線性關系。

3.6 穩定性考察

精密吸取同一批（20191122）供試品溶液，每間隔1h 進樣測定，RSD 為0.78%，n=6，說明供試品溶液在5h 內穩定。

3.7 精密度試驗

精密吸取上述供試品溶液，按照“3.1”項下色譜條件重復進樣5 次，RSD 為0.48%，表明儀器精密度良好。

3.8 重現性試驗

取同一批號樣品（20191122）溶液5 份，按照“3.3”項下方法制備供試品溶液，按“3.1”項下色譜條件進樣，測得甘草酸平均含量為0.6339mg/mL，RSD 為 0.506%，n=5。

3.9 加樣回收試驗

精密吸取已知含量的樣品（批號20191122），分別精密加入對照品0.6437mg，按照供試品溶液準備方法制備，按“3.1”項下色譜條件測定，結果平均回收率98.60%，RSD 為0.522%。見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n=5）

3.10 含量測定

分別精密吸取3 批樣品各3 份，按供試品溶液制備方法制備，按“3.1”項下色譜條件測定甘草酸含量。見表2。

表2 樣品中甘草酸含量測定（n=3）

4 討論

利尿合劑是本醫院中藥自制制劑，由葉下珠、白花蛇舌草、海金沙、一點紅、金砂藤等藥味組成，是泌尿系感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利等疾病治療的常規用藥。本課題前期研究表明，利尿合劑用于泌尿系感染患者104 例，臨床有效率為99.04%，明顯優于寧泌泰膠囊對照組的92.15%（P ＜0.05），尿急、尿頻癥狀消失時間和尿常規檢查白細胞計數、紅細胞計數好轉時間較對照組減少[2]。黃新凱等[3]觀察利尿合劑治療妊娠期泌尿系感染的療效，治療52 例治愈率為88%，療效明顯優于寧泌泰膠囊，治療后尿路刺激征消失時間和尿細菌培養轉陰數均優于寧泌泰膠囊對照組。潘佩嬋等[4]應用間歇導尿+ 口服利尿合劑預防脊髓損傷所致泌尿系感染效果顯著。雷素云等[1]應用利尿合劑治療慢性腎炎、膀胱炎等泌尿系感染，臨床總有效率為99.3%。臨床用于治療泌尿系統感染、慢性腎炎、膀胱炎、腎炎水腫、下焦不利有顯著的療效。本研究對利尿合劑中的主要中藥材白花蛇舌草、葉下珠進行了薄層色譜鑒別研究，結果顯示薄層色譜圖斑點清晰，并經多溫度、濕度、多種色譜板等條件考察，均顯示出清晰可分的色譜圖譜，方法穩定可靠，該方法可用于利尿合劑的薄層色譜鑒別[5-8]。

本品為復方制劑，甘草酸作為甘草藥材及含甘草制劑的質量控制指標性成分，在此選擇了甘草酸的含量測定對利尿合劑進行質量控制。參考《中國藥典》2015 版一部中甘草藥材項下的含量測定方法，對制劑中甘草酸進行含量測定。結果顯示，白花蛇舌草、葉下珠的薄層色譜斑點清晰，陰性無干擾。甘草酸在0.2162 ～1.081μg（r=0.9997）線性范圍內，呈良好的線性關系，肯定了本方法的應用價值。分析原因，本類檢測方法利用固定波長對薄層展開的各斑點進行掃描圖譜分析，具有更為客觀準確等優勢，重現性更高[9-11]，且可同時分析多個樣品，并進行分離，分離效率高，且其靈敏及準確性高的優勢也適用于利尿合劑的質量控制。圖像易于保存，各種優勢的存在肯定了其綜合的臨床應用效果[12-15]。綜上所述，該方法適宜于該制劑中甘草酸的含量測定，色譜峰分離度高、峰型好，且陰性無干擾。