A型肉毒毒素對兔肌腱成纖維細胞抑制作用的實驗研究

許良 王楠 曾林如

[摘要] 目的 探討A型肉毒毒素在體外動物實驗中對兔趾伸肌腱成纖維細胞的增殖活性的抑制作用，以及對相關細胞因子TGF-β1和bFGF表達的影響。 方法 體外分離兔趾伸肌腱，培養肌腱成纖維細胞，采取CCK8實驗檢測A型肉毒毒素在不同濃度條件下對成纖維細胞活性的影響。ELISA試劑檢測肌腱成纖維細胞中TGF-β1和bFGF的表達含量。 結果 與對照組相比，不同濃度的A型肉毒毒素對肌腱成纖維細胞的增殖活性有不同程度的抑制作用，在30 U/mL濃度時，抑制作用較低濃度10 U/mL和高濃度50 U/mL更為明顯。采用ELISA實驗檢測標本中TGF-β1和bFGF的表達含量。在三種A型肉毒毒素濃度條件下（10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL），實驗組中TGF-β1的表達濃度均低于對照組。在濃度為30 U/mL時，濃度降低最為明顯（P<0.05）。而實驗組中bFGF的濃度均高于對照組，在濃度為30 U/mL時，濃度升高最為明顯（P<0.05）。 結論 A型肉毒毒素能夠明顯抑制體外培養的兔肌腱成纖維細胞的增殖活性，降低TGF-β1 的表達水平，提高 bFGF的表達水平，在適合的濃度下，作用強度達到高峰，改善肌腱粘連癥狀。

[關鍵詞] A型肉毒毒素;肌腱粘連;成纖維細胞;動物實驗;TGF-β1;bFGF

[中圖分類號] R62 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）24-0028-03

[Abstract] Objective To investigate the inhibitory effect of botulinum toxin type A on the proliferative activity of rabbit extensor tendon fibroblasts in vitro and the effect on related cytokines TGF-β1 and bFGF. Methods Rabbit extensor tendon was isolated in vitro， and tendon fibroblasts were cultured. CCK8 assay was used to detect the effect of botulinum toxin type A on fibroblast activity under different concentrations. ELISA reagent was used to detect the expression levels of TGF-β1 and bFGF in tendon fibroblasts. Results Compared with those of the control group， different concentrations of botulinum toxin type A had different inhibitory effects on the proliferation of tendon fibroblasts. The inhibitory effect at 30 U/mL was more obvious than that at 10 U/mL and at 50 U/mL. The expression levels of TGF-β1 and bFGF in the specimens were determined by ELISA. Under the three concentrations of botulinum toxin type A （10 U/mL， 30 U/mL，50 U/mL）， the expression concentration of TGF-β1 in the experimental group was lower than that in the control group. At the concentration of 30 U/mL， the concentration decrease was the most significant（P<0.05）. The concentration of bFGF in the experimental group was higher than that in the control group， and the concentration was the highest at the concentration of 30 U/mL（P<0.05）. Conclusion Botulinum toxin type A can significantly inhibit the proliferative activity of rabbit tendon fibroblasts， reduce the expression of TGF-β1 and increase the expression of bFGF. At a suitable concentration， the intensity of action reaches a peak and it improves tendon adhesion symptom.

[Key words] Botulinum toxin type A;Tendon adhesion; Fibroblasts; Animal experiment; TGF-β1; bFGF

肌腱損傷術后發生的粘連，會嚴重影響關節功能的恢復[1]。如何緩解或防止肌腱及腱周組織粘連，盡早恢復其生理功能，同時又不影響肌腱本身的愈合，成為臨床及科研研究的焦點。一方面需要提高肌腱縫合的操作技術[2]，另一方面，需要局部用藥抑制肌腱成纖維細胞的生長，減少瘢痕的產生，避免肌腱粘連[3]。

A型肉毒毒素最早在美容整形科被廣泛應用，因其微創、高效、安全而備受青睞[4]。隨著研究的不斷深入，A型肉毒毒素被拓展應用于修復各種皮膚缺損，抑制皮膚瘢痕增生，并取得了理想的效果。A型肉毒毒素局部注射能使瘢痕變軟變平，瘢痕增生明顯改善[5]。在細胞體外實驗中，發現A型肉毒毒素能抑制成纖維細胞的生長和增殖，減弱局部成纖維細胞膠原蛋白的合成能力，有效緩解瘢痕生長[6]。本研究旨在進一步揭示A型肉毒毒素預防肌腱粘連的作用，擴大其治療范圍，為臨床藥物防治肌腱粘連提供新方案，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

5只新西蘭兔，體重3～3.5 kg，雌性，由浙江大學動物實驗中心提供，動物生產許可證號：SCXK（滬）2010-0028。在清潔環境中適應性飼養1周。注射用A型肉毒毒素（衡力BTX-A，100 U/支，國藥準字3109 70037），TGF-β1和bFGF的ELISA檢測試劑盒（杭州沃森生物科技有限公司），胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、DMEM培養液、磷酸鹽緩沖液、四甲基偶氮唑鹽等、電熱恒溫水浴槽、電子天平、臺式離心機、全自動酶標儀、倒置相差顯微鏡等。

1.2 方法

培養兔肌腱成纖維細胞，切取兔四肢趾伸肌腱，置于0.25%胰酶，4℃環境下24 h，打碎組織，加入0.25%Ⅰ型膠原酶，37℃環境孵育1 h，收集懸液，1000 rpm離心5 min，加入DMEM培養液，調整細胞密度至5×105/mL。在37℃、5%CO2條件下培養，每48小時換置培養液一次，細胞融合80%進行接種。實驗選用第4代至第5代細胞。

按照A型肉毒毒素濃度分為四組：對照組（0 U/mL）、10 U/mL組、30 U/mL組、50 U/mL組。取A型肉毒毒素（100 U/支），每組樣本份數20例，加入2 mL DMEM/F-12稀釋為50 U/mL后，按梯度稀釋至濃度30 U/mL、10 U/mL。取兔肌腱成纖維細胞，1000 rpm離心5 min，重懸稀釋于細胞計數板下計數，鋪96孔板，每孔5000個細胞，每組6個復孔，48 h后棄上清，每孔加入200 μL 10% 的CCK8檢測液，37℃避光反應1 h，450 nm處讀取各孔OD值。計算各組細胞的增殖活力，計算公式：細胞活力*（%）=[A（加藥）-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）]×100%。采用兔TGF-β1和bFGF的ELISA試劑盒檢測兔肌腱成纖維細胞在不同濃度的A型肉毒毒素條件下，培養48 h后培養基上清液中TGF-β1和bFGF的表達水平。

1.3 統計學分析

采用SPSS17.0統計學軟件分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，組內比較采用配對樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩組間比較采用Tukey HSD方法。計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兔肌腱成纖維細胞的形態學觀察

細胞貼壁生長良好，細胞界限清楚，胞體飽滿，排列較為緊密，大多呈現放射狀走形，見封三圖1。

2.2 A型肉毒毒素對肌腱成纖維細胞活性的影響

在4種濃度的A型肉毒毒素作用下，CCK8檢測盒檢測細胞活力，肌腱成纖維細胞的吸光度（OD）值隨著濃度的增加而下降。30 U/mL組對細胞增殖活性的抑制效果最顯著。A型肉毒毒素濃度為10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL時，檢測兔肌腱成纖維細胞的吸光度（OD）值，計算各組的細胞活力分別為（89.0±14.4）、（79.6±10.7）、（91.9±6.9），均低于對照組的（100.0±13.1），差異有統計學意義（P<0.05），濃度為30 U/mL時，差異最為明顯，對細胞活力的抑制作用最強。見表1。

2.3 A型肉毒毒素對兔肌腱成纖維細胞中TGF-β1和bFGF表達的影響

在A型肉毒毒素作用下，成纖維細胞中的TGF-β1的表達呈現不同程度的抑制作用。30 U/mL組抑制作用最明顯，而成纖維細胞中的bFGF的表達呈增加趨勢，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

外傷引起肌腱損傷在臨床工作中較為常見。盡管不斷改進肌腱修復技術，肌腱粘連仍作為最常見的并發癥嚴重影響創傷后肌腱的功能康復[7]。肌腱粘連與肌腱愈合有著重要聯系，肌腱在修復愈合過程中形成粘連的原因包括：①外源性愈合，因成纖維細胞在肌腱斷端大量生長，造成肌腱與周圍組織緊密粘連，影響肌腱滑動[8]，這是粘連形成的主要因素;②由于炎性反應導致周圍組織滲出增多，機化后粘連;③肌腱細胞自身增殖過程中與周圍組織形成粘連[9]。所以本實驗通過抑制肌腱的外源性愈合，減少肌腱成纖維細胞的大量增殖，以此來緩解肌腱粘連的癥狀，防治肌腱粘連。

肌腱在愈合的過程中，周圍組織會釋放各種細胞生長因子參與創傷修復，主要包括成纖維細胞轉化生長因子β1（TGF-β1）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）等[10]。研究發現TGF-β1通過對TGFβ/Smads信號通路的干擾，來抑制肌腱成纖維細胞轉化，一定程度上阻斷肌腱粘連的產生途徑，在創傷后的肌腱粘連中作用顯著[11]。有實驗研究通過檢測增生性瘢痕組織及皮膚組織中的TGF-β1表達水平，大樣本統計對比發現TGF-β1 在瘢痕組織中的表達水平顯著高于皮膚組織[12]。而生長因子bFGF的作用卻不同，研究顯示，能有效促進鞘管內肌腱的愈合，并且抑制鞘管內組織的粘連，緩解局部組織炎性反應。Oryan A等[13]造模兔屈肌腱損傷模型，通過局部注射bFGF，發現其能一定程度上調節炎癥反應，抑制腱周組織增生粘連，增加斷端膠原分泌，改善肌腱纖維的排列方式，調整組織損傷后的結構和生物力學性能。盛加根等[14]細胞實驗發現，局部使用bFGF及5-氟尿嘧啶在有效促進雞屈肌腱愈合的同時能減輕肌腱粘連。因此，細胞生長因子TGF-β1和bFGF作為監測肌腱粘連的重要參考指標，參與肌腱外源性愈合中瘢痕組織的形成機制，而被臨床醫師及科研工作者關注。在藥物防治肌腱粘連的攻堅戰中，治療方案各有不同。Tan V等[15]通過使用COX1和COX2抑制劑布洛芬，抑制局部炎性反應，防止肌腱修復后粘連的形成。Xia C等[16]利用6-磷酸果糖抑制TGF-β1和Ⅰ型膠原RNA的表達，有效防止粘連產生，同時對肌腱愈合無明顯影響。隨著研究的深入，各種方法的臨床應用較為局限，肌腱粘連仍未得到有效解決。

A型肉毒毒素臨床主要應用于皺紋的治療[17]，臨床神經藥理毒理作用研究較為豐富。隨著研究的深入，治療范圍逐漸擴大，用于治療皮膚大量瘢痕增生[18]，且對緩解燒傷后的組織瘢痕化效果明顯。于波等[19]在瘢痕局部注射A型肉毒毒素，有效減輕了患者早期瘙癢和輕度疼痛的癥狀，軟化皮膚瘢痕組織。同時，發現A型肉毒毒素可促進體外培養的瘢痕成纖維細胞的凋亡[20]。彭旦生[21]建立兔耳緣皮膚瘢痕模型，發現A型肉毒毒素緩解兔耳瘢痕增生，抑制局部攣縮的作用，是通過抑制成纖維細胞增殖或促進其凋亡，減少局部膠原的合成來實現的。

本研究發現在體外培養環境中，A型肉毒毒素對肌腱成纖維細胞的增殖活力會產生不同程度的抑制作用。在對照組中，兔肌腱成纖維細胞生長旺盛。當A型肉毒毒素濃度為10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL時，成纖維細胞鏡下觀察，發現數目減少、胞體減小、形態不典型、增殖活力減弱，在30 U/mL濃度時，增殖活力抑制最為明顯。采用ELISA實驗測定各組標本TGF-β1和bFGF表達含量。在三種A型肉毒毒素濃度條件下（10 U/mL、30 U/mL、50 U/mL），肌腱成纖維細胞中TGF-β1的濃度分別為0.68 pg/mL、0.64 pg/mL、0.74 pg/mL，均低于對照組濃度1.21 pg/mL（P<0.05）。在濃度為30 U/mL時，抑制作用最為明顯。肌腱成纖維細胞中bFGF的濃度分別為1.33 pg/mL、1.99 pg/mL、1.75 pg/mL，均高于對照組濃度1.31 pg/mL（P<0.05）。在濃度為30 U/mL時，促進作用最為明顯。由本研究可知，A型肉毒毒素可在一定程度上降低肌腱成纖維細胞TGF-β1的表達水平，從而抑制I型膠原、纖維結合素及α-SMA的表達，減少了肌腱成纖維細胞向瘢痕組織的轉化，避免肌腱周圍瘢痕組織增生。同時，A型肉毒毒素能上調bFGF的表達水平，增加膠原蛋白的分泌，防止過量的細胞外基質沉積，改善肌腱纖維的聚合和排列方式，抑制肌腱的粘連。A型肉毒毒素的作用效果并非隨著濃度的增加而遞增，在本研究中，當濃度為30 U/mL時，效果最為顯著，能有效抑制成纖維細胞的增生而緩解肌腱粘連。

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（收稿日期：2019-07-16）