自噬缺陷在動脈粥樣硬化中作用研究進展

李波 戴先鵬

[摘要] 自噬是一種亞細胞過程，在溶酶體降解蛋白質受損細胞器如線粒體過程中發揮重要作用。它對蛋白質和線粒體功能的調節和維持細胞穩態至關重要，而其失調則涉及多種疾病，如動脈粥樣硬化。最近有研究表明，無論動脈粥樣硬化斑塊中是否存在自噬刺激因子（例如活性氧、氧化脂質和細胞因子），動脈粥樣硬化進展期間都存在自噬缺陷。本綜述重點介紹了動脈粥樣硬化自噬缺陷的原因和后果，特別是對巨噬細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞的影響，對治療動脈粥樣硬化的自噬靶標可能具有重要意義。

[關鍵詞] 動脈粥樣硬化;自噬缺陷;巨噬細胞;血管平滑肌細胞;內皮細胞;細胞凋亡;衰老

[中圖分類號] R285 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）24-0187-06

[Abstract] Autophagy is a subcellular process that plays an important role in the process of lysosomal degradation of protein-damaged organelles， such as mitochondria. It is essential for the regulation of functions of protein and mitochondria and the maintenance of cellular homeostasis. The disorder of autophagy is related to many diseases， such as atherosclerosis. Recent studies have shown that autophagy defects exist during the progression of atherosclerosis， regardless of the presence of autophagy stimulating factors（such as reactive oxygen species， oxidized lipids and cytokines） in atherosclerotic plaques. This review focuses on the causes and consequences of autophagy defects in atherosclerosis， especially the impact on macrophages， vascular smooth muscle cells and endothelial cells， which may be of great significance for the treatment of autophagy targets for atherosclerosis.

[Key words] Atherosclerosis; Autophagy defects; Macrophages; Vascular smooth muscle cells; Endothelial cells; Apoptosis; Senescence

動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，其特征是大中動脈血管內膜中形成含脂質的斑塊。動脈粥樣硬化的危險因素包括高血壓、高膽固醇血癥、糖尿病、肥胖和吸煙，此外也認為老化是導致這種疾病的重要因素。根據流行病學研究表明，包括心肌梗死和中風在內的動脈粥樣硬化血栓性疾病的發病率和患病率與年齡呈正相關性。動脈粥樣硬化斑塊與主動脈瘤具有相似的病理特征，包括VSMCs衰老、ECM重塑和巨噬細胞介導的炎癥[1，2]，但是動脈粥樣硬化和腹主動脈瘤之間的關聯尚不清楚[3]。盡管應用降膽固醇療法（他汀類藥物）、外科手術（球囊血管成形術和支架置入術）和改變生活方式（飲食和體育鍛煉），動脈粥樣硬化仍然是發達國家的主要死亡原因之一。因此，需要進一步探索斑塊不穩定和破裂的機制以找到新治療方法來預防并發癥。最近有研究表明自噬缺陷在動脈粥樣硬化斑塊不穩定和疾病的整體發展中發揮重要作用。

自噬是一種亞細胞過程，主要生理功能是參與蛋白質和受損細胞器的降解。不同類型的自噬（巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬）取決于物質運送到溶酶體腔的輸送途徑。自噬的特征是吞噬雙膜囊泡中的細胞質物質形成自噬體隨后與溶酶體融合形成自噬溶酶體。然后，吞噬的物質在溶酶體水解酶作用下水解為氨基酸、碳水化合物、脂肪酸和核苷酸。通過生物分子的再循環，自噬為細胞功能和體內平衡提供了所需的物質來源。然而，當細胞內（例如，受損細胞器的積累）或細胞外因素（如營養缺乏、缺氧）應激刺激時，觸發自噬并保護細胞。在線粒體受損的情況下，通過PTEN誘導激酶（PTEN induced putative kinase 1，PINK1）和Parkin活化引發線粒體自噬。在線粒體膜電位喪失后，PINK1在外膜上積聚，募集Parkin，促進功能障礙線粒體的自噬降解。然而，重要細胞成分的降解和過度刺激自噬可導致自噬性細胞死亡。自噬體與特異性自噬相關蛋白（Autophagy-related protein，ATG）如ATG5和ATG7有關。這些蛋白質又受多種上游信號因子的調節，如mTOR和AMP激活的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）。在所有途徑中，最廣泛研究的是營養感應mTOR途徑。在營養缺乏的情況下，mTOR被滅活使得自噬介導的物質和能量供應的產生。在營養過剩的情況下，mTOR活化使得自噬失活。AMPK位于mTOR的上游，其活化導致mTOR抑制和誘導自噬。本綜述中，我們將討論自噬在動脈粥樣硬化中的作用，特別是自噬缺陷對斑塊中巨噬細胞、血管平滑肌細胞（VSMCs）和內皮細胞（ECs）的影響。

1 動脈粥樣硬化中的自噬

過去十年的研究已經發現動脈粥樣硬化中存在自噬現象。透射電子顯微鏡顯示自噬可以發生于人動脈粥樣硬化斑塊的所有細胞中（即巨噬細胞、VSMCs和EC）。對人頸動脈斑塊標本的VSMCs進行分析顯示，與正常健康的VSMCs相比，有絲分裂增加及PINK1水平升高[4]。然而，有癥狀和無癥狀患者的頸動脈斑塊的比較顯示，LC3-Ⅱ的表達降低了5倍。此外，對人和小鼠動脈粥樣硬化斑塊分析證明p62與斑塊共定位于巨噬細胞中[5]。小鼠動脈粥樣硬化斑塊中p62的表達也隨著年齡和斑塊負荷的增加而進一步升高[6]。

鑒于其在多泛素化蛋白質靶向自噬體降解過程中的作用，動脈粥樣硬化斑塊中p62水平的增加可反映出自噬缺陷。事實上，自噬缺陷可能發生于兩個不同的階段：（1）起始階段的缺陷，即自噬體的形成/成熟的階段;（2）與溶酶體融合階段和（或）溶酶體介導的降解過程中的缺陷。有研究表明動脈粥樣硬化中的自噬缺陷主要是由溶酶體依賴性途徑缺陷引起。晚期斑塊中的自噬在形成蠟樣脂過程中發揮重要作用。此外，廣泛或持久的氧化應激可破壞溶酶體膜的完整性，導致溶酶體水解酶的釋放并且不能充分去除受損的線粒體。此外，細胞色素c從受損的線粒體中釋放出來并可能促進細胞凋亡。最終，晚期動脈粥樣硬化斑塊中積聚的膽固醇晶體會破壞溶酶體膜，從而破壞自噬過程。這些發現表明晚期動脈粥樣硬化可破壞溶酶體介導的吞噬物降解，而不是破壞自噬體形成/成熟。因此，晚期病變中仍然可以激活自噬，以響應斑塊中存在的自噬誘導物如活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、氧化脂質和內質網（Endoplasmic reticulum，ER）應激，但該過程在第二階段缺陷，這取決于溶酶體依賴性吞噬物的降解。因此，溶酶體系統的功能，特別是轉錄因子EB（Transcription factor EB，TFEB）的作用，是溶酶體生物合成和自噬的主要調節因子，現已成為動脈粥樣硬化和其他脂質代謝相關疾病領域研究的重要課題[6，8，9]。另外，自噬是功能性的，但無法應對隨后斑塊中出現的過量氧化應激，導致細胞凋亡。因此，細胞保護性自噬途徑可能變成自噬性細胞死亡途徑，這取決于斑塊的發育階段。

2 自噬在巨噬細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞中的作用

體外實驗表明，不同的動脈粥樣硬化相關刺激在巨噬細胞、VSMCs和EC中可激活自噬。

在巨噬細胞中，自噬可以通過氧化修飾形成氧化型低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，oxLDL）和7-酮膽固醇直接或間接誘導ER應激。自噬通過受損蛋白質和細胞器的清除來促進巨噬細胞存活。此外，自噬通過調節溶酶體對脂滴的降解來促進巨噬細胞和泡沫細胞中游離膽固醇的釋放。巨噬細胞中的線粒體自噬可用不同物質（如LPS）誘導，并且需要p62重新定位到線粒體。功能喪失實驗表明受損線粒體的p62依賴性清除可以抑制核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）介導的炎癥。

與巨噬細胞相似，氧化脂質可激活VSMCs自噬并促進細胞存活。脂質過氧化產物4-羥基壬烯醛（4-HNE）可以激活VSMCs自噬，通過誘導ER應激來刺激4-HNE-修飾蛋白的清除。已證明oxLDL可刺激線粒體自噬作為抗VSMCs凋亡的保護機制[7]。人VSMCs與oxLDL接觸會引發線粒體自噬，這與PINK1和Parkin在受損線粒體外膜上的積聚有關[7]。此外，VSMCs自噬也可能受不同細胞因子（如骨橋蛋白、TNF-α）和血小板衍生生長因子（Platelet derived growth factor，PDGF）的調節。后者通過AMPK和mTOR非依賴性機制誘導VSMCs自噬，并保護VSMCs免受4-HNE誘導的細胞死亡。此外，PDGF促進形成不同VSMCs表型，其特征是遷移和增殖能力增強，收縮蛋白表達降低和VSMCs表面標志物的表達上調，表明自噬也可以影響VSMCs的表型和增殖。

同樣，在EC中也證明oxLDL可激活自噬以傳遞對內皮損傷的保護作用[10]。在攝取oxLDL后，轉移脂質到自噬體體內經溶酶體降解。然而，oxLDL也可能通過誘導ER應激引發自噬。X-box結合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）的mRNA剪接通過Beclin 1轉錄激活觸發EC自噬反應，Beclin 1是自噬中的關鍵組分。此外，晚期糖基化終產物（Advanced glycation end products，AGEs）等致動脈粥樣硬化因子引發EC自噬以防止內皮損傷。此外，已證明當EC受到血管壁上的層流血流引起的剪切應力時，可刺激自噬[11]。值得注意的是，只有高剪切力才能刺激EC中的保護性自噬，而低剪切應力通過mTOR活化和AMPK途徑抑制引起內皮自噬缺陷[11]。此外，用棕櫚酸處理EC會觸發PINK1-Parkin介導的線粒體自噬，以控制線粒體質量并防止EC損傷。除了能夠調節EC的存活外，自噬還涉及許多其他功能，如一氧化氮（Nitrous oxide，NO）產生、血管生成和血栓形成[12]。

通過細胞類型特異性自噬缺陷小鼠模型以研究自噬在巨噬細胞、VSMCs和EC中的作用。巨噬細胞中必需自噬基因Atg5的缺失導致ROS增加、細胞凋亡增加和細胞功能減退。后者表明吞噬細胞很難識別并清除因自噬缺陷而凋亡的巨噬細胞。此外，已證明巨噬細胞中的自噬缺陷會影響膽固醇合成，并且在用LPS和膽固醇晶體治療時可導致白細胞介素-1β（interleukin-1-beta，IL-1β）分泌增加。重要的是，巨噬細胞Atg7的缺失導致類似的效應，表明巨噬細胞的行為變化是由自噬的一般缺陷引起，而不是特異性自噬相關基因的缺陷引起。

與巨噬細胞不同，小鼠VSMCs Atg7的缺失不會誘導細胞凋亡，但會引發應激誘導的過早衰老，這是一種不可逆的生長停滯狀態，細胞保持代謝活躍，并經歷多種形態和功能變化。例如，Atg7缺陷型VSMCs核肥大、p16/RB介導的細胞周期停滯和衰老相關的β-半乳糖苷酶（beta-galactosidase，SAβG）活性減弱。Atg7缺陷型VSMCs還可以增加膠原蛋白含量、遷移潛力以及細胞因子轉化生長因子β（Transforming growth factor-beta，TGF-β）和基質細胞衍生因子1（SDF1）的蛋白質表達。根據實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應（Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分析，Atg7缺陷型VSMCs顯示IL-1β和NLRP3的mRNA水平增加，這表明炎癥過度活躍。Gardner等最近所述所有這些發現均符合人衰老VSMCs的典型特征，除了膠原蛋白含量增加。雖然小鼠衰老不同于人類，但不能排除增加的膠原蛋白含量可能與其他細胞通路的激活有關，而不是衰老表型本身的一部分。

當它們作為細胞保護途徑時，自噬與衰老呈負反饋，假定自噬為對抗細胞衰老的適應性反應機制[16，17]。通過清除損傷的線粒體和蛋白質聚集體，自噬可以分別抑制氧化和蛋白毒性應激的積累，因此可以負調節細胞衰老。已知老年組織中自噬標記物的表達減少及自噬相關基因的組織特異性敲除導致不同小鼠模型中早期衰老表型的發展。已證實mTOR抑制劑雷帕霉素誘導自噬可以抑制衰老[14，15]。

4.3 為什么自噬缺陷不會導致巨噬細胞衰老？

研究表明自噬受損的巨噬細胞不會發生細胞衰老。已經提出一些假設，但仍不清楚自噬缺陷型巨噬細胞不會衰老的原因。第一個假設與細胞內p62的水平有關。與VSMCs相比，Atg7缺陷型巨噬細胞的p62 mRNA表達水平未增加。因此，自噬缺陷型巨噬細胞中相對低水平的p62可能不能誘導衰老或激活Nrf2-ARE途徑。此外，巨噬細胞特異性Atg5缺陷型LDLR-/-小鼠的p62缺失并未改善，但會增加這些小鼠的致動脈粥樣硬化表型[5]。與p62感受態小鼠相比，這些雙敲除小鼠的斑塊的特征是凋亡增加、壞死、炎癥和不溶性多聚化蛋白的積累[5]。此外，由于缺乏p62依賴的炎性復合體清除，動脈粥樣硬化的增加與動脈粥樣硬化的增加有關，最近被描述為“在肉瘤中”[18]。

第二個假設是細胞對壓力的反應，這似乎是由它們的起源預先確定的。一般而言，血細胞生成細胞和生殖細胞通過細胞凋亡來應對壓力，而間充質細胞（例如成纖維細胞樣細胞）通過參與衰老程序來應對壓力。因此，VSMCs和巨噬細胞對自噬缺陷的反應不同可能在于起源不同。

第三個假設是細胞增殖和更新的能力。假定高度增殖細胞更容易因壓力而衰老，盡管情況恰恰相反。快速分裂細胞（如造血細胞和生殖細胞）在端粒縮短時會發生細胞凋亡而不是衰老。因此，這是一個需要進一步實驗證實的研究領域。

4.4 為什么自噬缺陷會導致巨噬細胞凋亡？

自噬缺陷型巨噬細胞中細胞凋亡易感性增加可能與細胞中ROS產生增加有關。有研究表明基本自噬蛋白的喪失通常與功能障礙的線粒體和ROS的累積增加有關，并且經常導致細胞死亡（凋亡）。這些發現與自噬作為管家和細胞保護機制的作用一致。通過限制氧化損傷和清除功能失調的線粒體響應ROS，隨后激活自噬以恢復體內平衡。因此，自噬缺陷可以導致ROS積累，反過來可以引發凋亡性細胞死亡。此外，線粒體自噬清除功能失調的線粒體，并且通過減少細胞色素c和其他促凋亡因子的釋放來預防細胞凋亡[7]。在營養物質耗竭的情況下，線粒體發生線粒體膜透化（Mitochondrial membrane permeabilization，MMP），但內源性營養素的自噬依賴性供應可逃避細胞死亡。然而，當自噬受到抑制時，細胞的生物能量狀態達到絕對最小值，不再清除發生MMP的線粒體，從而發生細胞凋亡。總之，認為自噬缺陷是氧化應激和細胞凋亡的主要原因，是動脈粥樣硬化斑塊去穩定化的已知因素。

4.5 為什么自噬缺陷會導致EC的凋亡和衰老？

與巨噬細胞和VSMCs不同，EC在自噬缺陷的同時發生細胞凋亡和衰老。已知EC自噬具有細胞保護作用，因此自噬缺陷可能導致凋亡。例如，抑制自噬可以消除過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）誘導細胞凋亡的作用。此外，過量的oxLDL會通過上調LOX-1清道夫受體阻礙保護性自噬反應，引發EC凋亡性死亡。體內實驗證實，EC特異性Atg5敲除小鼠的血管顯示EC凋亡率增加。然而，p53陽性細胞核增加可能與細胞凋亡無關，因為p53是引發衰老的急性DNA損傷反應途徑的核心組成部分。值得注意的是，EC在衰老時可以獲得一種原始表型。事實上，衰老EC對細胞凋亡刺激（如TNF-α、oxLDL和神經酰胺）較年輕EC更敏感，這可能是由于NO水平降低和ROS誘導損傷增加所致。因此，自噬缺陷EC的命運是衰老和細胞凋亡共同發生。由于適當的自噬對于保持EC功能至關重要，并且內皮功能障礙有助于動脈衰老，因此假設內皮自噬缺陷在衰老相關的動脈功能障礙中發揮直接作用。然而，需要進一步研究來確定自噬缺陷如何促進EC衰老。

5 檢測自噬和衰老的潛在缺陷

可以通過不同的方法檢測自噬，例如透射電子顯微鏡、蛋白印跡和免疫組織化學。這些技術都有其優點和局限性，如果不清楚其局限性，可能會對結果作出錯誤判斷[19]。此外，研究衰老過程中的自噬需要考慮一些額外因素，尤其是衰老相關的SAβG染色作為衰老標志物。SAβG是一種由衰老細胞表達的溶酶體酶，在氫離子濃度指數（Hydrogen ion concentration，pH）為6時具有最佳活性，可能反映衰老過程中溶酶體質量的增加。使用溶酶體抑制劑的實驗需要詳細解釋，因為它們可以通過增加溶酶體pH來阻斷自噬流體，從而可能錯誤地增加SAβG的水平。此外，由于膜與自噬體融合，自噬誘導的特征通常是溶酶體大小的增加，其可以影響SAβG染色。自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤在化療誘導衰老中的使用不穩定，因為它可以加強化療誘導的細胞凋亡，從而干擾衰老率。另外，p53途徑上調不僅是細胞凋亡的標志物，還可能表示衰老。

6 動脈粥樣硬化自噬的藥理學刺激

本綜述中描述了動脈粥樣硬化斑塊進展過程中自噬如何缺陷以及如何影響斑塊的穩定性。因此，我們建議刺激自噬作為動脈粥樣硬化的治療靶標。他汀類藥物家族的降膽固醇藥物具有很多作用（如抗炎作用、改善EC功能和穩定斑塊）[20]，已證明通過部分抑制mTOR通路刺激VSMCs自噬。最近發現其還具有抗衰老作用。他汀類藥物可預防EC和VSMCs衰老，這可能是由于它們能夠限制端粒縮短和氧化端粒DNA損傷。除他汀類藥物外，目前正在研究其他自噬刺激性化合物作為潛在的斑塊穩定療法。迄今為止，最有希望的化合物之一是雷帕霉素[或雷帕霉素衍生物（例如依維莫司）]，其通過抑制mTOR通路來刺激自身免疫。除了對藥物洗脫支架中VSMCs增殖的抑制作用外，這些mTOR抑制劑可引發一系列抗動脈粥樣硬化的作用，包括斑塊巨噬細胞的消耗、膽固醇的改善、降低全身和局部炎癥以及抑制斑塊內新生血管形成。此外，已證明mTOR抑制劑可抑制細胞衰老并延長各種動物的壽命[21]。這些數據被血糖和血脂水平所掩蓋，因此建議聯合使用二甲雙胍或他汀類藥物治療。此外，小鼠連續給予依維莫司治療導致mTOR過度活化和耐受以及肝組織中自噬減少[22]，因此建議采用間歇給藥方案。值得注意的是，mTOR抑制的部分有利效果與自噬誘導有關。mTOR抑制劑的一些有利效果僅基于細胞增殖的抑制。抗糖尿病藥物二甲雙胍通過激活AMPK間接刺激自噬和抑制mTOR。已知二甲雙胍可以減少糖尿病患者的并發癥，這可能超出其低血糖效應。二甲雙胍抑制血管衰老和炎癥，并可減輕糖尿病[23]和非糖尿病ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化[24]。二甲雙胍還通過AMPK依賴性方式減少線粒體碎片來改善線粒體質量[23]。雖然最近的研究表明二甲雙胍對EC的抗炎作用具有自噬依賴性[24]，但需要進一步研究來確定二甲雙胍有益于心血管的功能是否與自噬誘導有關。

因為線粒體自噬在動脈粥樣硬化中必不可少，所以需要新的藥理學化合物。通過抑制mTOR激活自噬可能足以清除受損的線粒體，盡管這是促進有絲分裂的非選擇性方法。線粒體融合（即片段化）或融合調節可能是靶向激活線粒體自噬的策略。例如，用動力蛋白相關蛋白1抑制劑mdivi-1治療可減少線粒體碎片并減弱糖尿病ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化[23]。然而，在這項研究中未闡明對線粒體自噬的特殊影響。用特異性線粒體靶向抗氧化劑治療可能是控制線粒體質量的另一種方法。盡管這些藥物可能無法改善清除受損線粒體，但它們可以阻止mtROS積累，從而抑制線粒體損傷并改善線粒體自噬[25]。

7 結論

在過去的幾年中，自噬已成為治療動脈粥樣硬化的新型治療靶點。多項研究表明自噬在動脈粥樣硬化進展期間失調;因此，研究其對斑塊穩定性的影響非常重要。有趣的是，自噬的遺傳破壞可能對巨噬細胞、血管平滑肌細胞和內皮細胞產生相反的作用。巨噬細胞通過細胞凋亡來應對自噬缺陷，而VSMCs通過衰老，盡管這兩種現象都可促進斑塊進展。因此，可以認為自噬是衰老和細胞凋亡之間的敏感控制開關。當自噬受損時，細胞有兩個主要選擇：死亡（通過凋亡）或適應（通過衰老）。然而，自噬缺陷的EC可以同時發生細胞凋亡和衰老。尚不清楚這些細胞類型特異性差異的原因，但可能涉及接頭分子p62積累或可能僅取決于細胞的起源和（或）增殖能力。盡管如此，研究發現p62在VSMCs衰老中發揮重要作用，因此可著重關注p62參與EC衰老和其他與年齡相關的過程。對于動脈粥樣硬化的治療，盡管可能發生細胞類型依賴性效應，但仍然支持使用自噬刺激方法。此外，過度誘導自噬可能引發自噬性細胞死亡，因此建議使用適當劑量。目前才開始特定研究線粒體自噬的藥理學方法的發展，但鑒于其在線粒體質量控制和衰老方面具有重要意義，可認為它們在未來治療心血管疾病方面具有非常重要的價值，未來的研究重點放在自噬/線粒體自噬刺激藥物的開發和測試上，優選具有抗衰老潛力的藥物。這種雙重作用的藥物不僅對動脈粥樣硬化的治療有積極作用，而且對于與年齡相關的心血管疾病也是如此。

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（收稿日期：2020-01-02）