HPLC 梯度洗脫法同時測定小兒葫蘆散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷含量

翟英英，位恒超

1.河南中醫藥大學第三附屬醫院藥學部，鄭州 450008；2.河南中醫藥大學，鄭州 450000

小兒葫蘆散是由橘紅、天麻、茯苓、天竺黃、葫蘆娥等13 味中藥材配伍加工而來，現收載于《衛生部藥品標準》中藥成方制劑第八冊［1］，具有化痰消食、鎮驚祛風的功效，主要用于痰喘咳嗽、脘腹脹滿、胸膈不利、吐乳不食、小兒驚風等病癥的治療［2］。方中橘紅為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥外層果皮，具有燥濕化痰、理氣寬中的功效，橙皮苷為其主要藥效成分；天麻為蘭科天麻屬植物天麻的干燥塊莖，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A等為其主要活性成分，具有抗癲癇、抗驚厥、鎮靜、鎮痛、平肝息風的功效，主要用于對小兒驚風、癲癇抽搐、破傷風等病癥的治療。現代研究表明小兒葫蘆散治療小兒支氣管炎［2］、小兒毛細支氣管炎［3］、急性支氣管炎［4］、小兒喘息性支氣管炎［5-7］、嬰幼兒肺炎繼發腹瀉［8］臨床療效確切，可有效改善患兒臨床癥狀，縮短治療時間，不良反應少。現行質量標準未對所含成分進行定量研究，難以全面評價小兒葫蘆散的整體質量。本文采用HPLC 梯度洗脫法，對小兒葫蘆散所含主要成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷同時進行測定，建立小兒葫蘆散多指標成分質量評價方法，為更加全面地評價小兒葫蘆散的質量提供參考依據。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-10ATvp 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；BS124S 型分析天平（德國Sartorius 公司）。天麻素對照品（批號：110807-201809，含量：96.7%）和橙皮苷對照品（批號：110721-201818，含 量：96.2%） 均購自中國食品藥品檢定研究院；巴利森苷E 對照品（批號：PRF16011523，含量：97.1%）和巴利森苷A對照品（批號：14122302，含量：98.4%）均購自成都普瑞法科技開發有限公司；甲醇為色譜純，其它試劑為分析純；小兒葫蘆散（生產企業：太原大寧堂藥業有限公司；批號：190303、190502、190701；批準文號：國藥準字Z14 021041；規格：每袋裝0.3 g）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液的制備精密稱取天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷對照品各適量，用甲醇制成濃度分別為0.152、0.178、0.416、0.934 mg/mL 的4 種對照品貯備液；精密量取上述對照品貯備液各2.5 mL，用甲醇定容至50 mL，制成混合對照品溶液（天麻素7.6 μg/mL、巴利森苷E 8.9 μg/mL、巴利森苷A 20.8 μg/mL、橙皮苷46.7 μg/mL）。

2.1.2 供試品溶液和陰性樣品溶液的制備取小兒葫蘆散內容物適量，研成細粉，取0.5 g，精密稱定，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流60 min，放冷，用甲醇補重，過濾，制成小兒葫蘆散供試品溶液。按小兒葫蘆散的處方工藝，分別制備不含橘紅、不含天麻的陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及專屬性試驗

采 用Agilent Extend C18色譜柱（200 mm × 4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ℃；流動相：甲醇（A），0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脫（0～8.0 min，12.0% A；8.0～26.0 min，12.0%～34.0% A；26.0～38.0 min，34.0%～42.0% A；38.0～45.0 min，42.0%～12.0% A），流速：0.8 mL/min；檢測波長分別為220 nm（0～26.0 min 檢測天麻素、巴利森苷E 和巴利森苷A）和284 nm（26.0～45.0 min 檢測橙皮苷），進樣量：10 μL。取“2.1.1”項下混合對照品溶液及“2.1.2”項下各溶液依法進樣檢測，記錄色譜圖，結果供試品色譜圖中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷色譜峰峰形對稱，與相鄰色譜峰分離度均＞1.5，理論塔板數按各成分色譜峰計均≥3500，色譜圖基線平穩；天麻陰性樣品色譜圖中未見天麻素、巴利森苷E和巴利森苷A 色譜峰，橘紅陰性樣品色譜圖中未見橙皮苷色譜峰，表明陰性樣品對小兒葫蘆散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的測定無干擾，色譜圖見圖1。

2.3 線性關系考察

量取“2.1.1”項下4 種對照品貯備液各0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，用甲醇定容至10 mL，制成6 個系列濃度的混合對照品溶液，依法進樣檢測天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面積，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，進行線性回歸，得各成分線性方程分別為Y天麻素=1.305 7×106X-913.7(r=0.999 3)、Y巴利森苷E=1.531 9×106X+385.2(r=0.999 9)、Y巴利森苷A=1.277 6×106X-1 012.4(r=0.999 5)、Y橙皮苷=9.864 9×105X+717.6(r=0.999 8)，天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮 苷 分 別 在1.52～30.40 μg/mL、1.78～35.60 μg/mL、4.16～ 83.20 μg/mL、9.34～186.80 μg/mL 范圍內線性關系良好。

2.4 精密度

取“2.1.1”項下混合對照品溶液連續進樣6次，測得天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷峰面積的RSD 分別為0.91%、1.27%、0.62%和1.44%。

2.5 重復性

取同一批次小兒葫蘆散樣品平行制備6 份，依法進樣檢測天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷峰面積，計算得4 種成分平均含量分別為0.316 mg/g、0.422 mg/g、0.879 mg/g、2.141 mg/g，RSD 分別為1.34%、0.85%、1.21%和0.76%。

2.6 穩定性試驗

臨用新配一份小兒葫蘆散供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h 進樣檢測天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面積，結果小兒葫蘆散供試品溶液24 h 內穩定，4 種成分峰面積的RSD 分別為1.59%、0.84%、0.36%和0.87%。

2.7 加樣回收率試驗

量取根據樣品含量另行配制的混合對照品溶液（天麻素0.078 mg/mL、巴利森苷E 0.104 mg/mL、巴利森苷A 0.216 mg/mL、橙皮苷0.532 mg/mL）2.0 mL、4.0 mL 和6.0 mL，分別置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，制成質量濃度相當于50%、100%和150%的回收混合對照品溶液，備用；取含量已知的同一批次小兒葫蘆散內容物適量，研細，稱取9 份，各約0.25 g，分別加入上述回收混合對照品溶液25 mL 各3 份，照“2.1.2”項下方法制成回收供試品溶液，依法進樣測定天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面積，計算各成分含量，用測得值與樣品原有量之差除以對照品加入量計算回收率，結果天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的平均回收率分別為98.42%、96.93%、99.49%、97.66%，RSD 分別為0.96%、0.67%、1.09%、0.77%。

2.8 樣品含量測定

取3 個批次的小兒葫蘆散樣品，每個批次平行制備3 份供試品溶液，依法進樣檢測天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的峰面積，采用外標法計算4 個成分的含量，結果見表1。

表1 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

小兒葫蘆散由橘紅、天麻、茯苓、天竺黃、葫蘆娥等13 味中藥組方而來，方中藥物均細粉直接入藥，考慮到所含組分較難提取完全，在供試品溶液制備過程中，首先在加熱回流提取60 min 的同一條件下，對比考察不同提取溶劑（甲醇、50%甲醇、95%乙醇、稀乙醇）對小兒葫蘆散中待測成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷綜合提取率的影響，同時兼顧雜質成分干擾大小等因素，結果以甲醇為提取溶劑時，綜合提取效果最佳，雜質對多成分同時測定的干擾較小；遂依次對提取方式和提取時間進行確認（超聲提取90 min、加熱回流提取90 min、加熱回流60 min、加熱回流30 min），結果超聲提取90 min 待測成分綜合提取率明顯低于加熱回流90 min 所得結果，加熱回流60 min 待測成分綜合提取率與加熱回流90 min 所得結果差異不大，但明顯高于加熱回流30 min 所得結果，故最終綜合考慮采用甲醇加熱回流提取60 min 對小兒葫蘆散進行處理。

3.2 色譜條件流動相的選擇

以小兒葫蘆散中待測成分天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷的分離效果為首要指標，同時兼顧分析檢測時間、色譜圖基線等因素，依次考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%冰醋酸溶液不同流動相體系，結果甲醇-水流動相體系優于乙腈-水體系，但待測成分巴利森苷A 存在拖尾現象；以甲醇-0.1%甲酸溶液流動相體系所得效果最佳，遂對流動相比例進行優化，最終確定按照“2.2”項下梯度洗脫的流動相比例對小兒葫蘆散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷含量進行同時測定。

4 結論

本實驗采用HPLC 梯度洗脫法同時對小兒葫蘆散中天麻素、巴利森苷E、巴利森苷A 和橙皮苷含量進行了測定，建立了小兒葫蘆散多指標成分質量控制方法，為全面評價小兒葫蘆散的產品質量提供了數據支持。