小麥纖維素顆粒微生物限度檢查方法適用性研究

張威存，黃麗華

1.廣州中醫藥大學第三附屬醫院，廣州 510360；2.廣東省藥品檢驗所，廣州510663

小麥纖維素顆粒約含80%的纖維素，其中不可溶性纖維素占比≥90%，是一種不能消化的純天然纖維素制劑，顆粒直徑0.8～2.0 mm，并含有大量親水羥基，增加糞便體積的同時增加其水結合能力，使糞便的體積和質量增大，促進腸蠕動功能，使得糞便排出更加順暢，是國家食品藥品監督管理局批準的治療便秘的制劑［1-4］。

藥品微生物限度檢查是目前藥物安全的一個重要且有效的手段［5］，為了確保小麥纖維素顆粒微生物限度檢查法的準確性和可靠性，保證藥品的用藥安全，參照《中國藥典》2015 年版微生物限度檢查方法［6］，根據小麥纖維素顆粒理化特性和微生物限度標準等因素選擇適宜的計數方法和控制菌檢查，并對其進行微生物限度方法適用性試驗，建立微生物限度檢查方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CL-40M 高壓滅菌器（日本ALP 株式會社）；GRX-12A 干熱消毒箱（上海森信實驗儀器有限公司）；LRH-250A 生化培養箱（廣東省醫療器械廠）；MIR-254-PC 恒溫培養箱（松下健康醫療器械株式會社）；BS323S 電子天平（賽多利斯公司，萬分之一）。

1.2 樣品

小麥纖維素顆粒，深圳市永科醫藥有限公司提供（生產企業：Sweden Recipharm Hoganas AB 公司；批號：250301、250302、250303，規格：每包3.5 g）。

1.3 方法適用性菌種

金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，乙型副傷寒沙門菌 ［CMCC（B）50094］，白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，均由中國食品藥品檢定研究院提供，菌種均為第三代。

1.4 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（簡稱TSA，批號：180124）；胰酪大豆胨液體培養基（簡稱TSB，批號：1073065）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（簡稱SDA，批號：171207）；沙氏葡萄糖液體培養基（簡稱SDB，批號：1071003）；pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號：181029）；麥康凱液體培養基（批號：1075425）；麥康凱瓊脂培養基（簡稱MAC，批號：1076291）；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（簡稱NAC，170605）；氧化酶試紙（批號：6105168）；甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：170509）；RV 沙門增菌液體培養基（批號：1086061）；木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（批號：180524）；三糖鐵瓊脂培養基（簡稱TSI，批號：1071771）。以上培養基均購自廣東環凱微生物科技有限公司，按使用說明書配制，使用前進行培養基適用性檢查，均符合規定。

2 方法與結果

2.1 計數方法適用性試驗與結果

2.1.1 菌液的制備分別將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種至TSB 中，置32 ℃培養箱中培養24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至SDB 中，置23 ℃培養箱中培養48 h；將上述菌株培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數為不大于104 cfu 的菌懸液，備用。接種黑曲霉的新鮮培養物至SDA 斜面培養基中，置23 ℃培養箱中培養7 d 后，加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液5 mL，將孢子洗脫，收集孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每l mL 含孢子數為不大于104 cfu的孢子懸液，備用。

2.1.2 供試液的制備取本品10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，搖勻，靜置5 min，取上清液作為1∶20 的供試液。

2.1.3 需氧菌、霉菌和酵母菌檢查方法適用性試驗試驗組：分別取上述菌懸液0.1 mL，加至10.0 mL 供試液中，使各試驗菌每1 mL 含菌量不大于100 cfu，混勻。分別取混勻好的溶液1 mL 注入平皿中，立即傾注相應的瓊脂培養基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌組傾注TSA，白色念珠菌、黑曲霉組分別傾注TSA 和SDA 2 種培養基），每株試驗菌平行制備2 個平皿，待凝，TSA 倒置于32 ℃培養箱培養3 d，SDA 倒置于23 ℃培養箱培養5 d，觀察培養結果，以平均菌落數作為最終結果。

菌液對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，按試驗組方法操作加入試驗菌液，并進行微生物回收試驗。供試品對照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同試驗組操作。

2.1.4 方法適用性試驗結果小麥纖維素顆粒微生物計數結果見表1，從表中可以看出1∶20 供試液微生物檢查中，需氧菌，霉菌及酵母菌總數計數的回收比值均在0.5～2.0 范圍內，且回收比值均在0.8以上，3 次均能重現試驗結果。故該計數方法適用于小麥纖維素顆粒的微生物檢查。

表1 小麥纖維素顆粒微生物計數方法試驗回收比值

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗與結果

本品控制菌檢查包括有大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、沙門菌。

2.2.1 菌液制備分別取大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養物接種至TSB 培養基中，置32 ℃培養24 h；培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每mL 含菌數不大于102 cfu 的菌懸液，備用。

2.2.2 供試液的制備取本品10 g，加pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至200 mL，搖勻，靜置5 min，取上清液作為1∶20 的供試液

2.2.3 大腸埃希菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數不大于102 cfu 大腸埃希菌的菌液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養24 h 后，取培養物1 mL 接種至100 mL 麥康凱液體培養基中，43 ℃培養48 h。取麥康凱液體培養物劃線接種于MAC 平板上，32 ℃培養72 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同陽性對照組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.4 銅綠假單胞菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數不大于102cfu 銅綠假單胞菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養24 h 后，取培養物劃線接種于NAC 平板上，32 ℃培養72 h 后，取平板上生長的菌落進行氧化酶試驗（用玻棒挑起新鮮培養物于氧化酶試紙表面，觀察菌落顏色，陽性為紅色，陰性不變色）。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.5 金黃色葡萄球菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取上述1∶20 供試液20 mL 及每mL 含菌數不大于102cfu 金黃色葡萄球菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養24 h 后，取培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，32℃培養72 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.6 乙型副傷寒沙門菌控制菌檢查法的適用性試驗陽性對照組：取供試品10 g 及每mL 含菌數不大于102cfu 乙型副傷寒沙門菌的菌懸液1 mL，加至200 mL TSB 中，32 ℃培養24 h 后，取培養物0.1 mL接種至10 mL RV 沙門增菌液體培養基中，32 ℃培養24 h。取少量RV 沙門菌增菌液體培養物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上，32 ℃培養48 h。若木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基平板上菌落生長良好，為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色時用接種針挑選疑似菌落于TSI 高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養24 h。

供試品對照組：取制備好的供試液，以pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，同試驗組方法操作。陰性對照組：取pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液替代供試液，不加菌液，進行陰性對照組試驗。

2.2.7 控制菌檢查法的適用性試驗結果小麥纖維素顆粒的控制菌檢查結果見表2。由表可見3 個樣品的陽性對照組結果均為陽性，分別檢出大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌這4 種控制菌，而供試品對照組及陰性對照組均為陰性，未檢出相應的控制菌。因此，小麥纖維素顆粒相應的控制菌可以按照《中國藥典》2015 年版四部通則1106 非無菌產品微生物限度檢查［6］，該方法對小麥纖維素顆粒的控制菌檢查適用性試驗成立。

表2 小麥纖維素顆粒控制菌檢查法的適用性試驗結果

3 討論

藥品微生物限度檢查的操作步驟繁雜，結果受多方面的影響［7］。為確保檢查方法的準確性和完整性，首先要確認其計數方法適用性試驗與控制菌檢查方法適用性試驗，以保證供試品中被污染的微生物能被檢出，結果方屬有效。

在小麥纖維素顆粒微生物檢查時，采用1∶20的稀釋倍數是由于本品吸水性較強，1∶10 的供試液很粘稠，無法吸取，故制成1∶20 的供試液進行計數方法適用性試驗與控制菌檢查方法適用性試驗。值得注意的是，供試品稀釋后需靜置5 min，使其充分溶解于pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，再進行下一步試驗。研究結果顯示，計數方法試驗中各試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內，且回收比值均在0.8 以上，說明該計數方法適用于小麥纖維素顆粒的需氧菌總數，霉菌及酵母菌的檢查。

小麥纖維素顆粒是從麥麩中提取的純天然纖維經過一定的加工而制成口服給藥制劑，《中國藥典》2015 年版四部通則［6］規定口服制劑控制菌檢查中不得檢出大腸埃希菌，因其含有純天然的植物成分，每10 g 供試品中還不得檢出沙門菌。另外，原料藥小麥麥麩屬于藥食同源的植物，查閱相關食品質量標準［8］發現金黃色葡萄球菌是常見的食源性致病菌，廣泛存在于自然環境中。它在適當的條件下，能夠產生腸毒素，可引發食物中毒，化膿性感染及中毒性休克等癥狀［9］。值得注意的是小麥纖維素顆粒的生產工藝中也涉及到對銅綠假單胞菌的控制，銅綠假單胞菌是一種重要的革蘭陰性條件致病菌，可引發人體呼吸道、泌尿道、消化道皮膚軟組織及手術創面等多部位的急性或慢性感染［10］。基于金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞桿菌的致病性，為了更加嚴格控制小麥纖維素顆粒的微生物限度安全，其控制菌檢查中還不得檢出金黃色葡萄球菌以及銅綠假單胞桿菌。

4 結論

在對3 批樣品進行的微生物限度檢查方法適用性試驗中，需氧菌、霉菌和酵母菌的各試驗菌回收比值均在0.5～2.0 范圍內，陽性對照組均檢出試驗菌，陰性對照組及供試品對照組均未檢出，該微生物限度檢查方法適用性成立。本文建立的方法適用于小麥纖維素顆粒的微生物限度檢查。