芪藶強(qiáng)心通過p-Erk/Nrf2 通路對心肌梗死小鼠細(xì)胞凋亡的影響

羅心霞，馬石楠，周君陽，王 玨，丁 妍，李東升*

（1.湖北醫(yī)藥學(xué)院 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，湖北 十堰 442000）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是冠狀動脈持續(xù)性缺血缺氧，導(dǎo)致相應(yīng)心肌缺血壞死，可并發(fā)惡性心律失常、心力衰竭、休克等，嚴(yán)重者可危及生命，是人類死亡的主要原因之一［1］。MI 在大多數(shù)發(fā)達(dá)國家有較高的發(fā)病率和死亡率，已成為一個重要的健康問題［2］。氧化應(yīng)激是心梗后心肌細(xì)胞凋亡的重要原因［3］。心肌細(xì)胞凋亡參與心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展［4］。心梗后心肌細(xì)胞凋亡增加，心臟重塑，最終導(dǎo)致心力衰竭［5］。因此，抑制心梗后氧化應(yīng)激，減輕心肌細(xì)胞凋亡對心梗治療有重要意義。芪藶強(qiáng)心（Qiliqiangxin，QLQX）是一種特殊的傳統(tǒng)中藥，具有抑制氧化應(yīng)激［6］、抑制細(xì)胞凋亡［7］等作用。目前國內(nèi)對該藥在心力衰竭作用機(jī)制方面研究較多，也有研究發(fā)現(xiàn)芪藶強(qiáng)心對心肌梗死有改善作用［8］，而芪藶強(qiáng)心對心梗后細(xì)胞凋亡的影響及具體作用機(jī)制目前研究較少。

細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，Erk）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上一種跨膜信號蛋白，氧化應(yīng)激時(shí)Erk 會自身聚合磷酸化活化，p-Erk調(diào)節(jié)下游分子發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。研究發(fā)現(xiàn)，核因子 NF-E2 相關(guān)因子（Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是p-Erk 的底物［9］。Nrf2 屬于CNC（Cap，n，Collar）家族轉(zhuǎn)錄因子，是抗氧化應(yīng)激的核心因子。研究發(fā)現(xiàn)Nrf2 及其下游基因通過抗氧化應(yīng)激對心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［10］。本研究通過建立小鼠心肌梗死和H9c2 細(xì)胞缺氧損傷模型，觀察芪藶強(qiáng)心對心梗后細(xì)胞凋亡的影響并探討其可能機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物與試劑 芪藶強(qiáng)心膠囊（批號Z20040141）購自石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，稱取芪藶強(qiáng)心膠囊粉末用無菌生理鹽水稀釋為質(zhì)量濃度25 mg/mL 溶液，用于小鼠灌胃；稱取芪藶強(qiáng)心膠囊粉末用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋為質(zhì)量濃度25 mg/mL 溶液，用于細(xì)胞培養(yǎng)。p-Erk 抗體（貨號4370S）購自美國Cell Signaling Technology 公司；Erk 抗體（貨號AF1051）、Tublin 抗體（貨號AF001）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Nrf2抗體（貨 號16396-1-AP）、Bcl-2 抗體（貨號12789-1-AP）、Bax 抗體（貨號50599-2-lg）購自美國proteintech 公司；DMEM（貨號12100046）、胎牛血清（貨號16140071）購自美國Gibco 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號A0208）、BCA 蛋白濃度試劑盒（貨號P0011）、極超敏 ECL 化學(xué)發(fā)光顯影液試劑盒（貨號P0018FM）、Erk 抑制劑PD98059（貨號S1805）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 動物與細(xì)胞 80 只健康雄性C57BL/6 小鼠，8～10 周，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK（鄂）2016-0008，飼養(yǎng)在湖北醫(yī)藥學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心SPF 級動物房中，動物飼養(yǎng)、處理和手術(shù)過程由湖北醫(yī)藥學(xué)院動物保護(hù)與使用委員會審核、批準(zhǔn)和監(jiān)督。H9c2 細(xì)胞由湖北醫(yī)藥學(xué)院賀細(xì)菊老師贈予，在5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)H9c2 細(xì)胞。

2 方法

2.1 造模 將80 只小鼠根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（n＝10）、心肌梗死組（n＝20）、假手術(shù)+芪藶強(qiáng)心組（0.25 g/kg）（n＝10）、心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組（0.25 g/kg）（n＝20）、心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組（0.5 g/kg）（n＝10）、心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組（0.75 g/kg）（n＝10）。心肌梗死模型的建立，小鼠前胸部備皮，異氟烷氣霧（1.5%～2%）麻醉小鼠。胸骨左緣3～4 肋間開胸，暴露心臟，小心剝離心包，找到左心耳，于左心耳下方約2 mm 處用6～0 眼科帶針縫合線結(jié)扎左冠狀動脈前降支，然后逐層關(guān)閉胸腔。假手術(shù)組開胸，但不結(jié)扎左冠狀動脈前降支，其余步驟同手術(shù)組。于術(shù)后第2天，小鼠灌胃給藥，給藥28 d。

2.2 組織蛋白的提取 將心臟標(biāo)本取出后，每10 mg心臟組織加100 μL 的裂解液（含1% PMSF和2%磷酸酶抑制劑）用電動研磨杵勻漿，勻漿后樣品置于冰上裂解30 min，每10 分鐘渦旋振蕩15 s，充分裂解組織細(xì)胞。于 4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，離心之后取上清液備用。

2.3 超聲心動圖檢測 給藥處理28 d 后，異氟烷氣霧麻醉小鼠，脫毛膏脫去胸前區(qū)毛發(fā)，用彩色多普勒超聲診斷儀對各組小鼠進(jìn)行心臟超聲心動圖檢測。用 M 型超聲測定左室舒張末期容積（LVEDV）、左室收縮末期容積（LVESV）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）和左室短軸縮短率（LVFS）。

2.4 細(xì)胞處理 取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞分為對照組（正常培養(yǎng)）、缺氧組（正常培養(yǎng)液中加入600 μmol/L CoCl2處理12 h）；芪藶強(qiáng)心組（缺氧組基礎(chǔ)上加入0.25 mg/mL 芪藶強(qiáng)心預(yù)處理24 h）；Erk抑制劑組（芪藶強(qiáng)心組基礎(chǔ)上加入Erk 抑制劑20 μmol/L PD98059 處理24 h）。加入含1% 苯甲基磺酰氟（PMSF）和2% 磷酸酶抑制劑的裂解液（RIPA）100 μL，待細(xì)胞充分裂解30 min 后，刮細(xì)胞使細(xì)胞懸浮，將細(xì)胞懸液移入EP 管中，于4 ℃下，12 000 r/min離心10 min，上清即為蛋白樣品。

2.5 Western blot 檢測 BCA 法測定組織及細(xì)胞蛋白濃度。將蛋白樣品和SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）按比例混勻，100 ℃變性10 min。12%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），用濕轉(zhuǎn)法（0.28 mA、90 min）轉(zhuǎn)至PVDF 膜（0.4 nm），5%的脫脂奶粉室溫下封閉2 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST 洗滌3 次，10 min/次。室溫下孵育二抗2 h，TBST 洗滌3 次，10 min/次。Image Lab 進(jìn)行顯影。Image J 軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

2.6 RTCA 檢測細(xì)胞增殖 采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記動態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)。常規(guī)培養(yǎng)H9c2 細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時(shí)用0.25% 胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)。每孔按3 000 個細(xì)胞接種于無菌的細(xì)胞增殖孔板（E-plate 16 孔板）中，每孔100 μL 細(xì)胞懸液。加入0.125、0.25、0.5、1.0 mg/mL 芪藶強(qiáng)心，并設(shè)立對照組，3 個復(fù)孔。按照儀器使用說明書，將E-plate 16 孔板放人事先調(diào)試好的儀器中培養(yǎng)30 h，自動實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞增殖情況并繪制曲線。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraghaPad Prism6 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 芪藶強(qiáng)心對心梗小鼠心功能的影響 0.5、0.75 g/kg 芪藶強(qiáng)心對MI 小鼠心功能沒有明顯改善作用（圖1A）；0.25 g/kg 芪藶強(qiáng)心可改善MI 小鼠心功能（圖1A～C），而對假手術(shù)組小鼠心功能沒有影響（圖1B～C）。Western blot 檢測顯示，0.25 g/kg芪藶強(qiáng)心可上調(diào)MI 小鼠Bcl-2 表達(dá)（P＜0.05，圖1D～E），下調(diào)Bax 表達(dá)（P＜0.05，圖1D～E），而0.25 g/kg 芪藶強(qiáng)心對假手術(shù)組小鼠凋亡標(biāo)志物蛋白（Bcl-2、Bax）沒有影響（圖1D～E）。后續(xù)動物實(shí)驗(yàn)采用0.25 g/kg 芪藶強(qiáng)心。

圖1 芪藶強(qiáng)心對心梗小鼠心功能的影響Fig.1 Effects of QLQX on cardiac function of MI mice

3.2 芪藶強(qiáng)心對心梗小鼠心肌組織細(xì)胞凋亡及p-Erk/Nrf2表達(dá)的影響 與假手術(shù)+生理鹽水組相比，心肌梗死+生理鹽水組Bcl-2 表達(dá)下降（P＜0.05），Bax 表達(dá)上升（P＜0.05），與心肌梗死+生理鹽水組相比，心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組Bcl-2表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），Bax 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。p-Erk/Nrf2 信號通路結(jié)果顯示，與假手術(shù)+生理鹽水組相比，心肌梗死+生理鹽水組p-Erk、Nrf2 表達(dá)下降（P＜0.05），與心肌梗死+生理鹽水組相比，心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組p-Erk、Nrf2 表達(dá)上調(diào)（P＜0.05）見圖2。

圖2 Western blot 檢測各組小鼠心肌組織蛋白表達(dá)（n=3）Fig.2 Detection of protein expression in mouse myocardium by Western blot（n=3）

3.3 芪藶強(qiáng)心對缺氧H9c2 細(xì)胞凋亡及p-Erk/Nrf2表達(dá)的影響 RTCA 結(jié)果結(jié)果顯示，0.25、0.125 mg/mL芪藶強(qiáng)心對H9c2 細(xì)胞生長無抑制作用，細(xì)胞毒性較小；而隨著藥物濃度的增加，芪藶強(qiáng)心（0.5、1.0 mg/mL）對H9c2 細(xì)胞增殖的抑制作用增加。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.25 mg/mL 芪藶強(qiáng)心，作用H9c2 細(xì)胞24 h（圖3 A）。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，缺氧組Bcl-2 表達(dá)下降（P＜0.05），Bax 表達(dá)上升（P＜0.05）；與缺氧組相比，芪藶強(qiáng)心組Bax 表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），Bcl-2表達(dá)上調(diào)（P＜0.05），見圖3B～C。芪藶強(qiáng)心預(yù)給藥與Erk 抑制劑PD98059 同時(shí)處理，與芪藶強(qiáng)心組相比，Erk 抑制劑組p-Erk 表達(dá)下降（P＜0.05），同時(shí)Nrf2，Bcl-2 表達(dá)下降（P＜0.05），Bax 表達(dá)增高（P＜0.05），見圖3D～E。

圖3 Western blot 檢測各組H9c2 蛋白表達(dá)（n=3）Fig.3 Detection of H9c2 protein expression in each group by Western blot（n=3）

4 討論

心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康［11］。氧化應(yīng)激是各種有害因素導(dǎo)致活性氧（ROS）產(chǎn)生過多，超過機(jī)體的抗氧化能力，引起組織細(xì)胞損傷。有研究證實(shí)氧化應(yīng)激反應(yīng)與心梗的嚴(yán)重程度相關(guān)［12］。心肌梗死后，氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、鈣超載等一系列病理生理改變［13］。而心肌細(xì)胞凋亡可使心室重構(gòu)，嚴(yán)重影響心功能。因此，抑制氧化應(yīng)激損傷，減輕心肌細(xì)胞凋亡，有利于心梗的治療。

芪藶強(qiáng)心是由黃芪、人參、附子、丹參、葶藶子、澤瀉、玉竹、桂枝、紅花、香加皮、陳皮11種中藥提取成分組成的傳統(tǒng)中藥，具有益氣溫陽、活血通絡(luò)、利水消腫的功效。方中君藥黃芪、附子，益氣溫陽；臣藥丹參活血通絡(luò)，人參補(bǔ)脾益肺、大補(bǔ)元?dú)猓闼炞訛a肺平喘、利水消腫；佐藥紅花活血化瘀，陳皮理氣化痰，澤瀉和香加皮強(qiáng)心、利水消腫，玉竹可養(yǎng)心陰；使藥桂枝溫陽化氣。目前對該藥在心力衰竭作用機(jī)制方面研究較多，有研究發(fā)現(xiàn)芪藶強(qiáng)心可抑制氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、減輕心室重構(gòu)［14］。也有研究發(fā)現(xiàn)芪藶強(qiáng)心對心梗大鼠有心肌保護(hù)作用，但是研究較少，具體機(jī)制并不清楚。本研究通過結(jié)扎左冠狀動脈前降支建立小鼠心肌梗死模型，發(fā)現(xiàn)心梗小鼠心臟組織抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax 表達(dá)增高，心肌細(xì)胞凋亡增加，而芪藶強(qiáng)心灌胃處理可以上調(diào)Bcl-2 的表達(dá)，下調(diào)Bax 的表達(dá)，心肌細(xì)胞凋亡減輕，說明芪藶強(qiáng)心可抑制心梗引起的細(xì)胞凋亡。

接下來研究芪藶強(qiáng)心減輕心梗引起的細(xì)胞凋亡的具體分子機(jī)制。Nrf2 是抗氧化應(yīng)激的核心因子，有抗氧化應(yīng)激以及維持氧化還原平衡作用，控制一系列抗氧化蛋白和解毒酶的表達(dá)［15］。多項(xiàng)研究證明Nrf2 對心肌損傷產(chǎn)生保護(hù)作用［16］。在心血管病的動物模型，如心肌缺血再灌注損傷［10］、主動脈弓縮窄術(shù)（TAC）引發(fā)的心力衰竭［17］中，也得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠心梗后心肌細(xì)胞凋亡增加，Nrf2 表達(dá)下降，考慮小鼠心梗后氧化應(yīng)激增強(qiáng)，而抗氧化應(yīng)激核心因子Nrf2 表達(dá)下降，小鼠抗氧化應(yīng)激能力下降，不能對抗心梗引起的心肌損傷，故心肌細(xì)胞凋亡增加。而當(dāng)給予芪藶強(qiáng)心灌胃處理后，Nrf2 表達(dá)上升，心肌細(xì)胞凋亡減少，說明芪藶強(qiáng)心可上調(diào)心梗引起的Nrf2 的下降，使小鼠抗氧化應(yīng)激能力增強(qiáng)，心肌損傷減輕。無論是在心肌梗死+生理鹽水組還是心肌梗死+芪藶強(qiáng)心組，Nrf2與p-Erk 蛋白表達(dá)變化趨勢一致。

Erk 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上一種跨膜信號蛋白，氧化應(yīng)激時(shí)，Erk 會自身聚合磷酸化活化，p-Erk 是Erk的磷酸化形式，具有活性，p-Erk 調(diào)節(jié)下游分子發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。Nrf2 是p-Erk 的底物。研究發(fā)現(xiàn)［18］活化的p-Erk 會促進(jìn)Nrf2 與胞漿蛋白Keap1解離，游離的Nrf2 轉(zhuǎn)位入核活化，與核內(nèi)抗氧化反應(yīng)原件ARE 結(jié)合啟動下游抗氧化蛋白的表達(dá)從而調(diào)控氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)Erk 信號通路在心臟中有保護(hù)作用［19］。芪藶強(qiáng)心可能通過激活p-Erk 的表達(dá)，促進(jìn)抗氧化應(yīng)激核心因子Nrf2 入核活化，進(jìn)而啟動下游基因表達(dá)，從而緩解小鼠心梗后細(xì)胞凋亡。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這一猜測。

綜上所述，芪藶強(qiáng)心通過激活p-Erk/Nrf2 信號通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激抑制小鼠心梗后細(xì)胞凋亡的作用。