漢桃葉的鎮痛藥效物質基礎研究

李莎 洪艷 韓笑 趙龍山 王洋

【摘 要】：目的：分離并篩選漢桃葉鎮痛的藥效的物質基礎，為漢桃葉和以漢桃葉為主藥材的制劑的質量控制方法建立和技術改造升級提供依據。方法：采用不同溶劑對漢桃葉進行提取，后采用大孔吸附樹脂法對漢桃葉提取物進行分離，獲得A組分（水洗脫部位）、B組分（10%-30%乙醇洗脫部位）、C組分（50%-75%乙醇洗脫部位）和D組分（有機酸部位）。通過熱板實驗對漢桃葉總提物和四個分離部位的活性進行測試，篩選藥效部位。結果：A、B、C組分均表現出了鎮痛活性，其中A組分的鎮痛活性較其他兩組更穩定，而C組分活性較B組分更強。通過進一步的成分分析，得出A組分多為單糖和多糖類物質，B組分含有大量黃酮和皂苷類物質，C組分含有大量的皂苷類物質。結論：漢桃葉中鎮痛活性與漢桃葉單糖和多糖關系更密切，與皂苷類物質含量也有一定相關性。

【關鍵詞】漢桃葉;鎮痛;藥效物質基礎

【中圖分類號】R282.5【文獻標識碼】A【文章編號】1672-3783（2020）07-21--01

漢桃葉為五加科植物白花鵝掌柴（ScheffierakwangsiensisMerr.exLi）的根或莖、葉，又名廣西鵝掌柴，產于貴州[1]。漢桃葉具有祛風止痛，舒筋活絡之功效。用于治療三叉神經痛，坐骨神經痛、風濕關節痛[2]，目前被做成多種中藥制劑上市，如漢桃葉膠囊，漢桃葉片等，應用較廣[2]。目前漢桃葉化學成分中有機酸類成分被認是藥效作用成分[3-5]。為進一步研究漢桃葉鎮痛活性的藥效物質基礎，本論文利用層析技術對漢桃葉進行分離得到不同極性部位，并采用薄層色譜法和紫外分光光度法對漢桃葉不同部位的化學成分進行分析，最終確定漢桃葉鎮痛活性的藥效活性成分。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL-104電子分析天平（德國梅特勒公司）;KQ-300DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;紫外分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）。

1.2 試藥

齊墩果酸（99.4%），蘆?。?9.4%）由深圳卓越生物科技有限公司提供;吲哚美辛由大連美羅藥業提供;香草醛（99%）購自天津大茂化學有限公司。生理鹽水和乙醇購自沈陽禹王有限公司。HP20大孔樹脂（批號7G504）購自日本日立公司，101*7陰離子交換樹脂，201*7陽離子交換樹脂購自寧波爭光樹脂廠。薄層層析板購自青島海洋化工廠。

1.3 動物

SPF級KM種小鼠，18-22g，雌性由沈陽藥科大學試驗動物中心提供，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

2 方法和結果

2.1 漢桃葉不同部位的富集

取漢桃葉藥材1kg，用70%乙醇提取兩次，過濾，回收醇提液，藥渣干燥，后按照藥典中水提醇沉方法再次提取藥渣，得到水提液。將醇提液與水提液合并，濃縮干燥得到浸膏粉末100g。取漢桃葉浸膏粉末65g，將其完全溶解于300ml的去離子水中，上樣至Hp20大孔吸附樹脂，依次用3倍柱體積的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脫，50℃減壓濃縮至干浸膏，后凍干至干燥粉末，得到水洗脫部位（20.8g，32%），10%乙醇洗脫部位（3.2g，4.9%），20%乙醇洗脫部位（5.5g，8.4%），30%乙醇洗脫部位（4.2g，6.4%），50%乙醇洗脫部位（10.3g，15.8%），75%乙醇洗脫部位（2.3g，3.5%），95%乙醇洗脫部位（0.67，1.0%）。通過薄層分析，將成分相似的部位合并，得到A組分（水洗脫部位，32%）、B組分（10%，20%，30%乙醇洗脫部位，19.9%）、C組分（50%，70%乙醇洗脫部位，19.3%）。

取漢桃葉浸膏粉35g溶解于200ml去離子水中，將浸膏溶液上樣于201*7陰離子交換樹脂上，收集1%HCl的洗脫液，后減壓蒸餾濃縮，得到初步有機酸富集部位浸膏液[3]。后取001*7陽離子交換樹脂800ml，將其進行溶脹、活化。將富集到的有機酸浸膏液100ml上樣，用4倍柱體積去離子水進行洗脫，回收洗脫液，減壓濃縮至濃浸膏，后置于凍干機上去除水分，得到D組分有機酸類富集組分（7.2g，20%）。

2.2 漢桃葉的鎮痛的藥效學實驗

2.2.1 給藥劑量確定

設定小鼠灌胃給藥體積為10mL/kg，在已有論文和前期預實驗的基礎上，設定漢桃葉總提物的實驗劑量為5g/kg/d。為提高藥效實驗的結果的顯著性，四個組分的給藥劑量之和是在總提物的1.8倍的實驗劑量（9g/kg/d）的基礎上，按照此部位占總提物的含量百分比進行換算得到的。這種換算方式在考察不同部位各自的藥效活性的同時，同時考慮了不同化合物的在總提物中的質量占比，與用藥實際情況更加符合。最終幾個部位給藥量分別為2.8g/kg/d（A組分），1.8g/kg/d（B組分），1.7g/kg/d（C組分），2.8g/kg/d（D組分）。

2.2.2 實驗方法

將雌性小鼠投入至熱板致痛儀中，將熱板致痛儀溫度控制在（55±0.5）℃，至出現舔后足的時間（s）作為該鼠的痛閾值，小于5s或大于30s或跳躍者棄之不用。篩選合格雌性小鼠，重復測其正常痛閾值，取兩次正常痛閾的平均值作為該鼠給藥前痛閾值。隨機分組，每組12只。

陰性對照組小鼠給生理鹽水，陽性對照組給吲哚美辛20mg/kg/d，漢桃葉A、B、C、D組每組每天按照小鼠體重以劑量0.1mL/10g灌胃給藥1次，連續7d。

測定小鼠給藥后第30、60、90、120min的痛閾值。如果痛閾超過60s，按60s記錄，并計算痛閾提高率。痛閾提高率（%）=（給藥后痛閾值-給藥前痛閾值）/給藥前痛閾值×100。

2.2.3 實驗結果

漢桃葉總體物在熱板鎮痛試驗中，四個時間點30min、60min、90min、120min與給藥前相比，均表現出鎮痛活性，痛閾值提高百分比分別為30%、82%、80%、50%（表1），效果弱于陽性藥吲哚美辛組。

在四個組分的熱板鎮痛試驗中，除D組未表現出鎮痛活性，其余三組均有鎮痛活性。其中，B組只在90min時表現出鎮痛活性，痛閾提高百分比為77.84%;C組鎮痛活性優于B組，在90min和120min均表現出鎮痛活性，痛閾提高百分比為116.23%和84.93%，且優于該時間點的陽性藥組吲哚美辛90min（88.27%）和120min（58.93%）。A組在四個時間點30min、60min、90min、120min與給藥前相比，均表現出鎮痛活性，痛閾值提高百分比分別為32.95%、46.82%、47.98%、60.12%，抗炎鎮痛活性弱于陽性藥組，但在30min和60min時間點優于C組。

2.3 藥效部位成分分析

2.3.1 薄層鑒別實驗

2.3.1.1 黃酮類成分薄層鑒別

將水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脫部位和有機酸部位用各自的洗脫溶劑溶解，總浸膏粉末和有機酸部位分別用20%甲醇和水溶解，依次于薄層板上點樣。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）為展開劑，三氯化鋁-乙醇溶液為顯色劑，在紫外波長365nm下進行觀察對漢桃葉提取物各部位進行分析，結果如圖1所示。

此反為鑒別黃酮類成分的常用方法，通過噴灑三氯化鋁顯色劑，黃酮類成分與三氯化鋁進行絡合，呈現黃色或藍色條帶。結果如圖1所示，在總提取物、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脫部位均出現明顯的熒光條帶，說明總提取物，藥效試驗B和C組分中中含有黃酮類成分。

2.3.1.2 皂苷類成分薄層鑒別

將水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脫部位和有機酸部位用各自的洗脫溶劑溶解，總浸膏粉末和有機酸部位分別用20%甲醇和水溶解，依次于薄層板上點樣。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）為展開劑，醋酐-濃硫酸溶液為顯色劑，對漢桃葉提取物各部位進行分析，結果如圖2所示。

醋酐-濃硫酸溶液為三萜和甾體皂苷的顯色劑，三萜皂苷會在顯色劑的作用下呈現紅、藍、紫等顏色的顯色但不出現綠色，甾體皂苷會經過一系列的顏色變化，最終顯綠色。如薄層色譜圖2可見，經過樹脂的分段，不同極性的化合物被成功分離到不同的富集部位?？偨?、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脫部位分別出現了紫色的顯色反應條帶，可知藥效試驗中總提取物，B組分和C組分均含有大量的皂苷。通過顏色可判斷皂苷類型主要為三萜皂苷。同時，根據顯色反應的條帶深淺程度，可判斷C組分含有皂苷含量較多。

2.3.2 漢桃葉總浸膏和各富集部位的總黃酮和總皂苷含量測定

在2015版藥典中，漢桃葉片是應用紫外光度法，以蘆丁為對照品測總黃酮的含量來進行質量控制，因此本實驗應用藥典中的總黃酮的測定方法對富集到的各個部位的總黃酮含量進行測定。通過已有的文獻報道和以上的薄層鑒別實驗我們知道漢桃葉含有大量的三萜皂苷類成分。有報道此類成分具有較好的鎮痛的藥效[8-10]，因此我們以齊墩果酸為對照品，測各部位中總皂苷類成分的含量。用以上兩實驗結果區別這兩類成分在各部位中的含量差異。

按中國藥典中黃酮總量的檢測方法進行操作，得到建立標準曲線為y=12.766x+0.0071。后取各樣品約0.16g對各部位中進行測試，結果見表1。按相關文獻中的方法繪制齊墩果酸的標準曲線，后對樣品進行測定。將樣品各稱取10mg溶解于5ml的甲醇中，得到5ml樣品液。按上述齊墩果酸標準曲線制備流程，對樣品液進行測定，將得到的數值代入線性回歸方程，計算出樣品中總皂苷含量，結果見表2。

由表1所示，在富集到各部位中，10%，20%，30%的乙醇洗脫部位（B組分）中含有黃酮量和皂苷含量最多。而水洗脫部位中黃酮含量約為4%，皂苷含量較少，推測多為單糖和多糖類物質。在B組分（50%，75%乙醇洗脫部位）中，皂苷和黃酮含量均小于4%。有機酸部位紫光吸光度示數過低，說明皂苷和黃酮含量極低。

3 結果與討論

結合以上化學組分分析和藥效活性實驗，可知在漢桃葉的鎮痛藥效活性中，A、B、C三個組分均表現出了鎮痛活性，其中A組分的鎮痛活性較其他兩組更穩定，而C組分活性優于B組分。這幾個部位中，A組分含有多為單糖和多糖類物質，B組分含有大量黃酮和皂苷類物質，C組分含有皂苷類物質。因此我們推斷，漢桃葉中鎮痛活性應該與漢桃葉單糖和多糖關系更密切，與皂苷類和黃酮類物質含量也有一定相關。因此在后續得質量控制中，可以加強這幾類特別是糖類物質的監測。

參考文獻

[1] 上海中藥一廠技術組， 漢桃葉有效成分的研究， 中成藥研究， 1978， 3， 6-11.

[2] 中國藥典（ 2015年版一部）〔M〕. 北京： 化學工業出版社， 2015： 812.

[3] 徐杰. 漢桃葉的化學成分研究[D].湖南中醫藥大學，2006.

[4] 潘力，廖厚知，齊艷輝.HPLC測定漢桃葉中反-丁烯二酸的含量[J].遼寧中醫雜志，2012，39（05）：906-907.

[5] 倪開勤，高效液相色譜法測定漢桃葉中有效成分含量[J].醫藥導報， 2013，32（8）： 1097-1098.

[6] 徐劍， 張永萍， 漢桃葉藥材含量測定方法的研究[J].貴陽中醫學院學報，2008，30（2）： 75-77

[7] 胡書平. 漢桃葉有機酸類成分研究及軟膏劑開發[D].中央民族大學，2012.

[8] 司敏，人參皂苷CK的抗炎鎮痛作用及相關機制[D].安徽醫科大學， 2018.

[9] 謝昧，人參皂苷Rg1抗炎、鎮痛作用及其作用機制[J].中國醫院藥學雜志，2013，19： 1592-1597.

胡楚璇，劉潔，郭小東.人參皂苷Rg_1鎮痛抗炎實驗研究[J].中藥材，2013，36（03）：464-467.