基于水通道蛋白AQP1/AQP3的表達探討石膏對急性軟組織損傷大鼠模型的影響

李心亮　李柯　劉月平　杜青　李若存

〔摘要〕 目的 研究生石膏和煅石膏對急性軟組織損傷大鼠模型水通道蛋白AQP1、AQP3表達的影響，對石膏消腫的作用機制進行初步研究。方法 采用砝碼自由落體運動制備急性軟組織損傷大鼠模型，造模成功后將動物隨機分為模型組，陽性藥組（雙氯芬酸0.75 g/kg），煅石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg）、生石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg），另設空白對照組，每組10只。除模型組與空白對照組外，其余各組均給予相應藥物，每天換藥1次，連續7 d。采用Western blotting和免疫組化法檢測各組大鼠損傷組織中AQP1/AQP3表達變化。結果 與空白對照組比較，模型組大鼠損傷骨骼肌中AQP1/AQP3表達明顯下降（P<0.01）;與模型組比較，煅石膏高、中、低劑量組和陽性藥組大鼠損傷骨骼肌中AQP1/AQP3表達明顯增加（P<0.01），生石膏組無明顯差異。結論 石膏煅制后可能通過調節急性軟組織損傷模型骨骼肌中AQP1/AQP3的表達從而發揮消腫的作用。

〔關鍵詞〕 急性軟組織損傷;煅石膏;生石膏;AQP1;AQP3

〔中圖分類號〕R285.5;R648? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.003

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of raw Gypsum Fibrosum and calcined Gypsum Fibrosum on Aquaporin AQP1 and AQP3 expression in acute soft tissue injury rats， and to preliminarily explore the swelling alleviating mechanism of Gypsum Fibrosum. Methods Acute soft tissue injury rat model was prepared by free-fall weight. After successful modeling， animals were randomly divided into a model group， a positive drug group （Diclofenac 0.75 g/kg）， a calcined Gypsum Fibrosum high， medium and low dose group （1.0， 0.5， 0.25 g/kg）， a raw Gypsum Fibrosum high， medium and low dose group （1.0， 0.5， 0.25 g/kg）. Another blank control group was set， with 10 rats in each group. In addition to the model group and the blank control group， the other groups were given corresponding drugs， dressing once a day for 7 days. Western blotting and immunohistochemistry were used to detect the expression changes of AQP1/AQP3 in the rats injured tissue of each group. Results Compared with the blank control group， the expression of AQP1/AQP3 in skeletal muscle of model rats decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of AQP1/AQP3 in injured skeletal muscle of calcined Gypsum Fibrosum high， medium and low dose groups and positive drug group rats were significantly increased （P<0.01）， and there was no significant difference in the raw Gypsum Fibrosum group. Conclusion Calcined Gypsum Fibrosum may play a role in eliminating swelling by regulating the expression of AQP1/AQP3 in skeletal muscle of acute soft tissue injury model.

〔Keywords〕 acute soft tissue injury; calcined Gypsum Fibrosum; raw Gypsum Fibrosum; AQP1; AQP3

急性軟組織損傷是指機體在遭受外力下引發的皮下、肌肉組織或韌帶等局部毛細管破裂出血和細胞內液滲透的運動系統常見疾病[1]。臨床主要表現為損傷處局部腫脹、疼痛、瘀斑等，嚴重影響了患者身心健康。中藥外敷治療急性軟組織損傷歷史悠久，且療效顯著。石膏在臨床上生、煅兼用，功效各異，但其緩解創傷性軟組織腫脹的具體作用機理尚未明確。骨骼肌富含水分，約占整體的76%，水的代謝對于骨骼肌正常生理功能的維持具有重要作用[2]。現代研究證明，水分子的跨膜運輸主要是通過膜上一類水通道蛋白（Aquaporins， AQPs）進行[3]。AQPs家族中，AQP1是體內分布最廣泛的水通道蛋白，并高度表達于骨骼肌微血管內皮細胞上，AQP3作為水甘油通道部分在骨骼肌上表達，與組織和細胞的水平衡及調節有著密切關系[4]。石膏的消腫作用是否與調節AQP1/AQP3的表達相關有待進一步探討。基于此，本實驗通過研究急性軟組織損傷后骨骼肌中AQP1/AQP3的變化，探討石膏發揮消腫作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

健康雄性SD大鼠，SPF級，體質量180～220 g，90只，雌雄各半，購自湖南長沙斯萊克景達動物實驗公司。在光/暗周期為12 h/12 h（光照時間7：00-19：00），溫度為18～22 ℃的條件下飼養于籠中，自由獲得飼料和飲水。實驗動物許可證：SYKX（湘）2015-0008，動物合格證號：43006700010860 。

1.2? 藥物與試劑

煅石膏用大豆油（煅石膏66%∶大豆油34%）配制，由湖南省中醫藥研究院中藥研究所課題組提供，生產批號：20151026;生石膏用大豆油（生石膏66%∶大豆油34%）配制，由湖南省中醫藥研究院中藥研究所制劑室提供，批號：20151026;雙氯芬酸，北京諾華制藥有限公司生產，規格：20 g/支，批號：X4447;AQP1一抗，美國RD公司，批號：154131;AQP3一抗，美國RD公司，批號：150925;山羊抗鼠lgG二抗，賽默飛世爾，批號：150725。

1.3? 主要儀器

正置熒光顯微鏡及圖像分析系統（Cail Zeiss），垂直電泳槽、轉膜槽（美國Bio-Rad公司），核酸蛋白濃度測定儀（BioDrop），WD-9405B型水平搖床（沃德生物醫學儀器公司），Bio-Rad凝膠成像系統（美國伯樂）。

1.4? 造模

參考文獻[5]的方法建立急性軟組織損傷大鼠模型，取SD大鼠適應性喂養3 d后，采用10%硫化鈉溶液脫除大鼠小腿部鼠毛，將大鼠固定于動物臺上，用自制質量為160 g的撞擊器，固定高度，撞擊大鼠小腿中部外側，連續打擊7次，接觸面直徑0.8 cm，造成打擊處腫脹，皮下瘀血，局部軟組織挫傷;其中，打擊處皮膚無破損，手觸無骨折，無其他異常者視為造模成功。

1.5? 分組及干預

造模成功后將動物隨機分為模型組，陽性藥組（雙氯芬酸0.75 g/kg）、煅石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg）、生石膏高、中、低劑量組（1.0、0.5、0.25 g/kg），另設空白對照組，每組10只。模型組與空白對照組不作處理，其余各組在受創部位經皮膚給予相應的藥物，每天換藥1次，連續給藥7 d。

1.6? 樣本采集

實驗結束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，采用10%水合氯醛（0.3 mL/kg）麻醉動物，剪取損傷部位肌肉組織約1 g，放入生理鹽水中清洗掉表面血跡后，立即剪取一半組織放入凍存管中，放入液氮速凍，-80 ℃冰箱保存備用;剩余組織放入4%的多聚甲醛溶液中固定保存備用。

1.7? Western-blotting實驗

將50 mg肌肉組織放入研缽中，加入液氮不斷研磨成粉狀，然后將粉末置入1 mL的組織裂解液中，混勻后置于冰上裂解30 min，離心（10 000 r/min、4 ℃、5 min）。取上清液，BCA法測蛋白濃度。配制10%SDS-PAGE凝膠，濃縮膠5%，取50 μg蛋白質樣品，加入等體積上樣緩沖液中，100 ℃沸水中煮5 min，上樣，電泳85 V、30 min，待染料前沿進入分離膠后，130 V約1.5 h。濕轉100 V、70 min;封閉2 h，TBS-T漂洗2次，加入一抗，4 ℃下反應過夜，TBS-T漂洗10 min×3次，加入二抗，室溫下孵育60 min，TBS-T漂洗10 min×3次，最后經ECL發光液顯影。采用凝膠成像分析軟件分析，Image J軟件掃描圖片得出各蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內參，進行半定量分析。

1.8? 免疫組化實驗

取出保存在4%的多聚甲醛液中的樣本，分別石蠟包埋，制成5 μm的切片;脫蠟至水，沖洗，滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，去除多余的液體;加一抗4 ℃過夜，PBST漂洗3次，每次5 min;再加入二抗，37 ℃濕盒避光孵育30 min，脫水封片。在光學顯微鏡下觀察每張玻片上3個不重復視野中AQP1和AQP3的陽性細胞（陽性細胞為棕褐色），采用ZEISS圖像分析軟件計算各組免疫陽性細胞的數量。

1.9? 數據處理

數據采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理，計量資料采用“x±s”表示，多組間比較方差分析采用單因素分析。組間比較采用t檢驗。若P<0.05

表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? Western-blotting檢測

與空白對照組比較，模型組大鼠肌肉組織中水通道蛋白AQP1、AQP3表達均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥組、煅石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中水通道蛋白AQP1、AQP3表達均顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）;生石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中AQP1、AQP3的表達均無明顯改變，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表1，圖1-2。

2.2? 免疫組化檢測

與空白對照組比較，模型組大鼠AQP1及AQP3的表達明顯減少;與模型組比較，煅石膏高、中、低劑量組大鼠AQP1及AQP3的表達均顯著升高差異有統計學意義（P<0.05或P<0.01），生石膏高、中、低劑量組大鼠肌肉組織中AQP1、AQP3的表達均無明顯改變，差異無統計學意義。結果見表2，圖3-4。

3 討論

急性軟組織損傷是臨床上常見的多發病，嚴重影響著我國約20%以上成年人、50%以上老年人的生活質量[6]。因此，明確急性軟組織損傷的分子機制，可以更好的為臨床應用提供用藥依據。研究發現，損傷處腫脹多因局部組織細胞等被破壞，瘀血停滯互結，血流不暢、微循環紊亂所致。中醫臨床常采用局部外用藥，可降低藥物的毒副作用，并通過維持皮膚表面相對穩定的血藥濃度，延長藥物作用時間而發揮顯著療效[7]。石膏是中醫臨床最為常用礦物藥之一，生品因其清熱瀉火、除煩止渴之功，多用于熱病氣分證，而煅制后性寒微弱，清熱之力減弱，收濕生肌作用增強。本課題組前期研究發現，石膏煅制后能夠明顯的改善急性軟組織損傷模型大鼠證候積分，發揮明顯的抗炎消腫作用[8]。煅石膏除常用于外治潰瘍不斂，濕疹瘙癢，水火燙傷，外傷出血外，外敷治療跌打損傷引起的紅、腫、熱、痛，作為醫院制劑已在多家醫院生產使用[9-12]。中醫學認為“濕”就是由于水分不能暢通而滯留在組織所引起的病癥，煅石膏能治療軟組織損傷的腫脹，是因其有收濕的作用，收濕作用可能為煅石膏的物理性質，因石膏煅后極易吸水。但這一推測并不能完全說明煅石膏的作用機制[13]。

AQPs是屬于水或溶質通道家族的一類蛋白，廣泛表達于上皮和內皮以及其他類型細胞如表皮、脂肪細胞和骨骼肌中，可以促進滲透細胞質膜的水分運輸，從而響應滲透梯度[14]。其中，AQP1是AQPs家族中最早被鑒定出來的水通道蛋白，以三維結構四聚體形式選擇性分布在上皮及內皮細胞中，維持液體平衡及協同水跨膜轉運[15]。文獻報道，AQP1在心肌水腫和缺血-再灌注損傷中起了重要的作用[15];并參與了大鼠骨骼肌內液平衡及水代謝[16]。AQP1還代表了微血管壁整個通過細胞間的10%～45%的液體滲透性，與血管的滲透性密切相關[17]。AQP3是皮膚中基底表皮細胞質膜強烈表達的水-甘油轉運蛋白，在骨骼肌中位于細胞膜的表面，對于細胞正常生理狀態的維持有著重要意義，其可促進皮膚水化，參與傷口愈合期間的細胞遷移[18];AQP3敲除小鼠的研究同樣顯示，AQP3促進水和甘油轉運以及損傷后傷口愈合[19]。急性軟組織損傷后，局部代謝微環境的改變，可能存在酸性代謝產物的堆積、滲透壓的變化、微循環障礙，從而導致細胞腫脹，影響AQP1和AQP-3的表達。AQP1和AQP-3表達的上調可能正是骨骼肌適應損傷后細胞代謝微環境改變以維持細胞正常生理活動的結果，二者可能通過參與水跨膜轉運以達到減輕組織腫脹的目的[2，20]。本實驗采用生、煅石膏對急性軟組織損傷模型大鼠進行干預，比較發現煅石膏可明顯緩解損傷部位水腫癥狀，而生石膏作用不明顯。Western-blotting檢測結果發現，模型組大鼠損傷組織中AQP1和AQP3積分光密度值降低，免疫組化法檢測損傷組織中上述蛋白的免疫陽性細胞數結果與Western-blotting法檢測結果趨勢相同，而給予煅石膏干預后可明顯逆轉這些變化。故實驗結果可分別從蛋白定性、定量的不同維度說明：石膏煅制后改善急性軟組織模型大鼠組織水腫，可能與調節細胞中AQP1和AQP3的表達，促進大鼠骨骼肌水代謝、維持骨骼肌液體環境平衡相關。本實驗的結果為煅石膏臨床治療軟組織損傷的作用機制提供了依據。

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（本文編輯? 楊? 瑛）