益腎通癃膠囊對前列腺增生模型大鼠雌雄激素比及缺氧誘導因子-1α的影響

涂雅玲　陳其華

〔摘要〕 目的 探討益腎通癃膠囊對前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）模型大鼠雌雄激素比及缺氧誘導因子1α（chypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的影響。方法 對SD雄性大鼠皮下注射丙酸睪酮5 mg/（kg·d），連續4周。造模成功后將大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、中藥對照組和實驗組，每組7只。實驗組大鼠灌服0.365 g/kg益腎通癃膠囊混懸液;中藥對照組灌服0.183 g/kg癃閉舒膠囊混懸液;正常組及模型組給予同等容量的生理鹽水灌胃，連續灌胃8周后，光鏡下觀察前列腺組織病理學變化;稱取前列腺濕重并計算前列腺指數;檢測大鼠血清E2、T、DHT水平及E2/T;測定前列腺組織中HIF-1α蛋白表達。結果 與模型組比較，實驗組大鼠前列腺腺體輕微增生，少數呈乳頭狀增生，腺腔基本恢復正常。與模型組比較，實驗組大鼠前列腺體積、前列腺濕重、前列腺指數及前列腺組織中的HIF-1α蛋白表達水平均降低（P<0.01）;大鼠血清中的DHT、E2、T水平降低，E2/T比值升高（P<0.01）。結論 益腎通癃膠囊可能通過降低BPH模型大鼠血清中的DHT、E2、T水平，升高E2/T比值，抑制HIF-1α的表達起治療BPH的作用。

〔關鍵詞〕 前列腺增生;益腎通癃膠囊;雌雄激素比;缺氧誘導因子

〔中圖分類號〕R285.5? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Yishen Tongzhi Capsules on the estrogen and androgen ratio in rat model of benign prostatic hyperplasia and the effects on hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α）. Methods SD male rats were injected subcutaneously with testosterone propionate 5 mg/（kg·d） for 4 weeks. After successful modeling， the rats were randomly divided into 4 groups： a normal group， a model group， a Chinese medicine control group and an experimental group， with 7 rats in each group. Rats in the experimental group were administrated with 0.365 g/kg Yishen Tonglong Capsules Suspension; the Chinese medicine control group was administrated with 0.183 g/kg Longbishu Capsules Suspension; the normal group and the model group were given the same volume of saline. After 8 weeks of continuous intragastric administration， the histopathological changes of prostate were observed under light microscope; The prostate wet weight was measured and the prostate index was calculated; The rat serum E2， T， DHT levels， and E2/T were detected; HIF-1α protein expression in prostate tissue was measured. Results Compared with the model group， the prostate glands of the experimental group had a slight hyperplasia， and a few showed papillary hyperplasia. The glandular cavity returned to normal. Compared with the model group， rats in the experimental group had reduced prostate volume， wet prostate weight， prostate index， and HIF-1α protein expression levels in prostate tissue （P<0.01）; DHT， E2， and T levels in rat serum were reduced. E2/T ratio increased （P<0.01）. Conclusion Yishen Tonglong Capsules may treat BPH by reducing the levels of DHT， E2， T in the serum of BPH model rats， increasing the E2/T ratio and inhibiting the expression of HIF-1α.

〔Keywords〕 prostatic hyperplasia; Yishen Tonglong Capsules; estrogen and androgen ratio; hypoxia-inducible factor

前列腺增生（benign prostatic hyperplasia，BPH）是中老年男性常見疾病之一[1]，是以排尿不暢、夜尿增多、尿頻、排尿費力、尿線中斷為主要臨床癥狀的一種疾病，屬中醫學“精癃”范疇[2]。該病的發病率隨年齡增長而增高，50歲以上發病率大于50%，80歲以上發病率達83%，關于BPH的病因和發病機制的研究頗多，主要有雌雄激素協同學說、生長因子學說以及細胞凋亡與基因調控學說等，但至今其發病機制仍未完全闡明[3-4]。研究發現大鼠前列腺組織及血清中缺氧誘導因子1α（chypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）水平與BPH發生有密切關聯[5]。筆者導師根據多年臨床經驗，創制了治療BPH療效較好的益腎通癃膠囊[6]，本研究通過觀察益腎通癃膠囊對雌雄激素比及HIF-1α表達的影響，以深入探討益腎通癃膠囊治療BPH的機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1? 實驗動物

36只健康雄性SD大鼠，體質量200～220 g，8周齡。由湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物實驗室提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

1.2? 藥品與試劑

益腎通癃膠囊，規格為0.4 g/粒，人用量為6粒/次，2次/d，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供。癃閉舒膠囊，規格：0.3 g/粒，人用量為3粒/次，2次/d，石家莊科迪藥業有限公司。丙酸睪酮注射液：25 mg/mL，天津金耀藥業有限公司。睪酮（T）檢測試劑盒（貨號CSB-E05100r）、大鼠雌二醇（E2）檢測試劑盒（貨號CSB-E05110r）、大鼠雙氫睪酮（DHT）檢測試劑盒（貨號CSB-E07879r）均購自武漢華美生物工程有限公司。抗β-肌動蛋白抗體（貨號bs-0061R）、缺氧誘導因子1α/低氧誘導因子-1抗體（貨號bs-0737R）均購自北京博奧森生物技術有限公司。

1.3? 主要儀器

酶標儀（型號：Multiskan Sky，賽默飛世爾科技公司）;離心機（型號：SCILOGEX CF1524R，美國賽洛捷克公司）;電子天平（型號：Scout STX，武漢集思儀器設備有限公司）;電泳儀（型號：DYCZ-40K，北京六一生物技術有限公司）。

1.4? 造模與給藥[7-8]

36只健康雄性SD大鼠，8周齡，適應性喂養1周后，將大鼠隨機取11只作為正常組，其余25只作為造模組，每天予以皮下注射5 mg/（kg·d）丙酸睪酮，連續注射4周后，隨機取正常組和造模組各4只大鼠，比較兩組大鼠的前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數，光鏡下評價大鼠前列腺組織形態結構的變化，判斷模型是否制備成功。將造模組剩下的21只大鼠隨機分模型組、中藥對照組和實驗組，每組各7只。造模成功后開始給藥，大鼠實驗用劑量采用人與動物的體表面積計算法來換算得大鼠益腎通癃膠囊的灌胃劑量為0.365 g/（kg·d），癃閉舒膠囊的灌胃劑量為0.183 g/（kg·d）。每天給實驗組大鼠灌服“益腎通癃膠囊”0.365 g/（kg·d）;中藥對照組灌服“癃閉舒膠囊”0.183 g/（kg·d）;正常組及模型組予以生理鹽水灌胃，連續灌胃8周，灌胃結束后進行相關檢測。

1.5? 檢測指標

1.5.1? 各組大鼠前列腺組織形態變化? 取大鼠前列腺組織固定于10%福爾馬林溶液中，之后予以乙醇脫水、石蠟包埋、切片、常規HE染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠前列腺組織形態結構的變化。

1.5.2? 各組大鼠前列腺體積、濕重及前列腺指數? 將大鼠稱重后迅速處死，剖取前列腺組織，用水取代法測量前列腺體積，稱取大鼠前列腺濕重，計算前列腺指數。

前列腺指數=前列腺濕重/大鼠體質量×100%

1.5.3? 大鼠血清E2、T、DHT及E2/T指標檢測? 剖腹后采腹主動脈血，以3 000 r/min 4 ℃離心15 min后，取上清液裝入普通試管，存放于-70 ℃冷凍箱中，按照試劑盒說明書進行相關測定。

1.5.4? 大鼠前列腺組織HIF-1α蛋白表達量? 取大鼠前列腺組織，置于勻漿器球狀部位，用剪刀盡量剪碎組織塊后，加入800 μL含PMSF的裂解液冰上進行勻漿，重復碾轉數次盡量碾碎組織，冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后，取上清分裝于1.5 mL離心管中，保存于-80 ℃冰箱。實驗時，取100 μL不同處理的組織蛋白樣本，BCA法測蛋白濃度，隨后加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min后，取20 μg進行電泳分析。電泳結束后，按照“三明治”模式，300 mA 2 h將凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，使用HIF-1α一抗，并4 ℃孵育過夜。隨后用1% TBST洗膜3次后，使用HRP二抗在室溫孵育1.5 h，再用1% TBST洗膜3次。最后用ECL化學發光試劑盒進行顯影，使用Image-Pro Plus圖像分析管理軟件進行灰度掃描，以特異性條帶平均光密度與面積的乘積為有效值，來反映蛋白表達水平。

1.6? 統計學方法

所有數據采用SPSS 21.0統計軟件進行處理，數據用“x±s”表示，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1? 大鼠前列腺組織形態變化

正常組（圖1A）見大鼠前列腺腺體排列均勻，腺體間間質明顯，腺上皮細胞呈單層柱狀;模型組（圖1B）見大鼠前列腺腺體顯著增生，腺腔變大，大小不一，多數腺上皮呈乳頭狀增生向腺腔內突出，間質內炎性細胞浸潤伴纖維組織增生，說明造模成功。中藥對照組（圖1C）見大鼠前列腺腺體和部分纖維組織仍增生明顯，較模型組有一定改善;實驗組（圖1D）見大鼠前列腺腺體輕微增生，腺上皮多為柱狀單層，少數呈乳頭狀增生，腺腔基本恢復正常，較模型組有很大改善。

2.2? 各組大鼠前列腺體積、濕重及前列腺指數

與正常組相比，模型組大鼠前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數均顯著增加（P<0.01），說明造模成功。與模型組相比，實驗組和中藥對照組BPH模型大鼠前列腺體積、前列腺濕重和前列腺指數均降低（P<0.01）。見表1。

2.3? 各組大鼠血清雌雄激素水平

與正常組相比，模型組大鼠血清DHT、E2、T明顯升高（P<0.01），E2/T明顯降低（P<0.01）。與模型組相比，中藥對照組和實驗組大鼠血清DHT、E2、T均降低（P<0.01），E2/T明顯升高（P<0.01）。見表2。

2.4? 各組大鼠前列腺組織中HIF-1α蛋白表達水平

與正常組比較，模型組大鼠HIF-1α水平顯著增高（P<0.01）;與模型組相比，中藥對照組和實驗組HIF-1α水平均降低（P<0.05，P<0.01）。見圖2。

3 討論

BPH是臨床常見的中老年男性良性疾病，該病病機復雜，病程較長，嚴重影響患者生活質量，西醫治療該病以藥物和手術治療為主，常用藥物有α1受體阻斷劑和5α-還原酶抑制劑，其作用是緩解尿路癥狀，解除梗阻，延緩進程，抑制并縮小前列腺體積、降低遠期并發癥等[9]。對于具備手術指征而無手術禁忌癥，且藥物治療效果不明顯的患者，則采取手術治療，但手術治療有一定風險。中醫學認為本病基本病機為腎虛血瘀，治療以補腎益氣，活血化瘀為主[6]。精癃的發生關鍵在于腎氣虧虛，氣虛則腎與膀胱氣化無力，統攝失權，夜尿頻多;氣虛至血行無力，氣虛瘀阻，引起局部組織器官增生。因此，以補腎益氣，活血化瘀為基本治法，并創制益腎通癃膠囊，其藥物組成有：黃芪、補骨脂、水蛭、枸杞子、山藥、熟地黃、山茱萸、金櫻子、茯苓、甘草等。方中補骨脂、黃芪共為君藥以補益腎氣;水蛭破血逐瘀;山藥、山茱萸、熟地黃、枸杞滋補腎陰，寓陽中有陰，陰中有陽之意;金櫻子酸澀收斂，固精縮尿;茯苓益氣健脾，甘草調和諸藥;全方共奏補腎益氣，化瘀縮尿之功效。

前列腺是雄激素依賴性器官，雄激素是調控前列腺生長、結構維持及功能完整的重要激素。但雄激素并不是引起BPH發生的唯一性激素，雌激素在BPH發生中也發揮重要作用，但雌激素在BPH中發揮作用需以雄激素存在為前提，在一定雌/雄激素比例范圍內時，可協同雄激素促進前列腺增生[10]。因此調節雌/雄激素比對于治療前列腺增生有重要作用。本研究發現，與模型組比較，益腎通癃膠囊可顯著降低大鼠血清中的DHT、E2、T水平，升高E2/T比值（P<0.01），說明益腎通癃膠囊可能通過降低血清中DHT、E2、T水平，升高E2/T比值，從而達到抑制前列腺增生作用。

近期研究發現，HIF-1α可能是激活“血管生成開關”的關鍵信號因子，其能夠導致各種血管生長因子的表達增加，包括VEGF和堿性成纖維生長因子（bFGF）[9]。周鵬等[11]發現前列腺內注射A型肉毒毒素可以通過抑制HIF-1α和VEGF的表達，從而抑制前列腺組織的血管形成，使前列腺體積縮小;并探討其可能機制是隨著前列腺體積不斷增大，導致血供不足出現缺氧壞死，缺氧會誘導HIF-1α過度表達，從而增加VEGF的過表達，進而誘導新生血管的形成，導致前列腺增生的發生。本研究也發現模型組大鼠前列腺組織中HIF-1α水平顯著增高（P<0.01），而益腎通癃膠囊能顯著降低大鼠前列腺組織中的HIF-1α水平（P<0.01），說明益腎通癃膠囊可能是通過抑制HIF-1α的表達，達到治療前列腺增生的作用。

參考文獻

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（本文編輯? 蘇? 維）