中藥注射劑類過敏反應研究進展

文雯　梁慧慧　余格　趙 靖　李原華　劉文龍　劉紅宇

〔摘要〕 中藥注射劑（traditional chinese medicine injections，TCMIs）臨床療效確切，但其類過敏反應頻發，日益增多的不良反應事件已成為當前中藥安全性研究的熱點和難點。類過敏反應的發生機制尚未完全明確，其常規評價標準及風險防控措施還存在一定局限性，亟需建立一套能廣泛篩查TCMIs類致敏原、明確類致敏發生機制的TCMIs安全性評價方法。本文對近年來有關TCMIs類過敏反應的機制、物質基礎以及評價方法的研究進行綜述，旨在深入挖掘TCMIs類過敏反應的綜合信息，以期為建立TCMIs類過敏反應評價與風險防控新方法、減少TCMIs臨床不良反應的發生提供新的思路。

〔關鍵詞〕 中藥注射劑;類過敏反應;不良反應;物質基礎;細胞模型;動物模型

〔中圖分類號〕R28? ? ? ?〔文獻標志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.026

〔Abstract〕 Traditional Chinese medicine injections （TCMIs） have definite clinical efficacy， while their anaphylactoid reactions are frequent， and the increasing number of adverse reaction events has become a hot and difficult point in the research of Chinese materia medica safety. The mechanism is not completely clear， and there are still some limitations in conventional evaluation criteria and risk control measures. It is urgent to establish the safety evaluation methods for TCMIs， which can widely screen the allergens and clarify the mechanism of anaphylactoid reactions. In this paper， the research on the mechanism， material basis and evaluation methods of TCMIs anaphylactoid reactions in recent years were reviewed. The purpose is to dig out the comprehensive information related to the reactions， in order to provide the ideas for establishing a new risk control method for anaphylactoid reaction evaluation， so as to reduce the occurrence of clinical adverse reactions of TCMIs.

〔Keywords〕 traditional Chinese medicine injections; anaphylactoid reactions; adverse reactions; material base; cell model; animal model

中藥注射劑（traditional chinese medicine injections，TCMIs）是由中醫藥理論指導，采用現代科學技術與方法，從中藥、天然藥物的單方或復方中提取有效物質制成的可供注入體內（包括肌內、穴位、皮內、皮下、靜脈以及其他組織或器官）的滅菌制劑以及供臨床前配制溶液的無菌粉末或濃縮液[1]。TCMIs療效確切、生物利用度高、起效快，解決了中醫臨床沒有急癥用藥的痼疾[2-3]。近年來，TCMIs的發展道路頗為坎坷，原因是隨著臨床的廣泛應用以及不良反應監測力度增強，有關TCMIs的不良反應報道越來越多，在國家藥品不良反應監測中心發布的《國家藥品不良反應監測年度報告（2017年）》中，TCMIs占中藥不良反應/事件報告的54.6%[4]。TCMIs的臨床安全飽受爭議，給TCMIs行業敲響了警鐘。自2006年魚腥草注射液不良反應事件爆發至今，國家食藥總局已宣布限用、禁用多種TCMIs，并要求部分品種修改說明書。

TCMIs的不良反應以（類）過敏反應為主[5]，其中類過敏反應（Anaphylactoid reactions）約占77%，主要表現在皮膚、消化系統、呼吸系統、神經系統、心血管系統等，包括皮膚黏膜紅腫、瘙癢、腹痛、惡心、胸悶、呼吸困難以及血壓下降等癥狀，甚至會發生休克和死亡[6]。類過敏反應的發生機制尚未完全明確，其常規評價標準及風險防控措施還存在一定局限性，亟需建立一套能廣泛篩查TCMIs的類致敏原、明確類致敏機制的TCMIs類過敏反應評價方法。本文將從TCMIs引發類過敏反應的機制、物質基礎和評價方法三個方面對近年的相關研究作出綜述，并對研究存在的不足展開討論，以期為進一步研究和風險防控新方法的建立提供思路和參考。

1 類過敏反應發生的機制

TCMIs類過敏反應的發生機制可能與肥大細胞（mast cell，MC）脫顆粒釋放組胺（Histamine， HIS）、補體系統的激活、花生四烯酸代謝等有關，可通過以下幾個環節激發。

1.1? 直接刺激MC

潘衛松等[7]研究發現，清開靈注射液（Qingkailing injection，QKLI）不含HIS類物質的情況下可引發小鼠類過敏反應，且MC膜穩定劑色甘酸鈉（可抑制MC脫顆粒）對其具有干預作用，提示QKLI可直接刺激MC脫顆粒釋放內源性HIS從而引發小鼠類過敏反應。

1.2? 補體激活

血清補體主要有C1～C9[8]等9種，激活的途徑有激活經典途徑、激活旁路途徑和甘露聚糖結合凝集素（mannan-binding lectin，MBL）途徑，這3條途徑最終都是通過形成C3轉化酶，釋放C3a、C5a過敏毒素等補體活化片段，可與MC表面的C3aR和C5aR結合，使體內外靶細胞脫顆粒，引起機體類過敏反應。樊孟[9]研究發現雙黃連注射液（Shuanghuang？鄄lian injection，SHLI）和香丹注射液均可通過補體激活相關機制致小鼠類過敏，此外還有研究表明，脂質體、聚氧乙烯蓖麻油（cremophor EL，erEL）、造影劑RCM和吐溫-80等均可激活補體系統途徑而致敏[10-11]。

1.3? 激活Ca2+通道

TCMIs致敏原可通過激活G蛋白，進而激活蛋白激酶C和Ca2+相關信號通路，胞內Ca2+濃度上升時，RBL-2H3細胞脫顆粒并釋放HIS、β-氨基己糖苷酶等生物介質，從而致類過敏發生[12-13]。

1.4? 其他通道

張波等[14]在QKLI誘發類過敏反應的研究中發現QKLI可激活RBL-2H3細胞內磷脂酰肌醇3-激酶（ phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、Rac1、PAK1蛋白參與調節細胞骨架重排，PAK1同時可激活LIMK1酶，LIMK1酶再反向激活Cofilin。因此致使RBL-2H3細胞內PI3K活性提高，使Rac1、PAK1、LIMK1和Cofilin蛋白含量呈劑量性增高，提示QKLI的類過敏反應可能是由基于細胞流動性改變，PI3K-Rac1細胞運動信號轉導通路引起細胞骨架重排所致。

2 類過敏反應發生的物質基礎

引起TCMIs類過敏反應的因素是多方面的，如藥物制備工藝不規范，使制劑內大分子物質殘留[15]，臨床上不按中醫證候辨證施治原則施藥、配伍不當、超適應癥和超劑量給藥[16-18]，以及患者的個體差異（年齡、性別）[19-20]等。在TCMIs致類過敏反應的相關物質基礎研究中，發現其輔料和原藥材成分皆具有類致敏性。

吐溫-80常作為增溶性輔料應用于TCMIs。已有研究證明吐溫-80和魚腥草注射液存在的嚴重不良反應有密切關系[21]。吐溫-80導致的類過敏反應，可能與其外源性大分子雜質有關[22]，目前的工藝還無法完全除去這些雜質。TCMIs的成分TCMIs由植物原藥材提取加工而成，成分多且復雜，部分成分同時也具有類致敏作用。如SHLI中的綠原酸、隱綠原酸和黃芩苷可使HBL-2H3細胞脫顆粒[23-24];人參皂苷Rd和人參皂苷20（S）-Rg3能顯著提高RBL-2H3細胞中HIS、β-己糖胺酶的釋放和磷脂酰絲氨酸的轉移，增加MPMCs和LAD2細胞的細胞內Ca2+濃度[25-26];靜脈注射三七總皂苷制劑可引起小鼠耳廓血管通透性增高，耳廓明顯藍染肥大以及MC脫顆?，F象[27]，均提示以上成分具有潛在的類致敏作用。此外小分子物質5-羥甲基糠醛（5-Hydroxymethylfurfural，5-HMF）廣泛存在于糖類TCMIs中，其濃度較高時還可檢測到一定濃度的二聚體雙-（5-甲?；坊┟眩?，5'-Oxydimethylenebis（2-furfural），OBMF），林琳[28]首次發現二者可引起體外MC發生類過敏反應和Ⅰ型超敏反應，后者的生成會增加前者的免疫毒性。

3 類過敏反應的評價方法

3.1? 體外細胞模型

3.1.1? MC模型? 類過敏體外實驗研究一般都采用原肥大細胞或嗜堿性粒細胞，MC是類過敏反應主要效應細胞，其能通過脫顆粒分泌HIS，各種炎癥和免疫調節物質從而引起機體生理及病理的變化[29-30]。這類模型多以靶細胞為研究對象，探求其類過敏介質的釋放機制，細胞脫顆粒率、細胞超微結構變化、HIS、β-己糖苷酶為RBL-2H3細胞脫顆粒的重要評價指標[31]。常用的MC如下。

RBL-2H3細胞具有MC的許多生物學特性，具有靈敏、快速、方便的特點，現已廣泛用于藥物類過敏反應的體外研究。范姍姍等[32]建立了基于實時細胞分析（real-time cell analysis，RTCA）系統的RBL-2H3細胞類過敏反應評價方法，以細胞指數（cells index，CI）、細胞形態、骨架變化和HIS和β-已糖苷酶釋放量為考察指標，可敏感的評價RBL-2H3細胞脫顆粒，并已成功用于20個批次的注射用益氣復脈（凍干）的類過敏反應評價。Han Shengli等[24]建立了RBL-2H3/CMC在線液質聯用系統（LC/MS），通過體外RBL-2H3細胞脫顆粒、己糖胺酶釋放實驗和LC/MS的成分篩查，成功鑒定出黃芩苷是SHLI中潛在的類致敏原。王化龍等[33]運用RBL-2H3細胞脫顆粒模型與高內涵檢測結合的方法，對細胞脫顆粒囊泡和細胞核染色標記，計算出30批次紅花注射液的細胞脫顆粒率，驗證了紅花注射液的類致敏作用，與傳統方法檢測的結果高度一致，是一種更靈敏、可靠且可實現高通量篩選的新評價手段。韓森等[34-35]建立的RBL-2H3細胞胞內Ca2+濃度及致敏介質檢測的方法比傳統方法更加方便、快捷，同時還可以避免β-氨基己糖苷酶檢測方法中因藥物顏色干擾而出現的假陽性結果，具有較高的應用前景。

小鼠肥大細胞瘤細胞P815因具有MC的特殊性質而被發現，逐漸被用于體外過敏反應研究[36]。Peng Bo等[37]發現在相同刺激條件下，compound40/80（C48/80）激活RBL-2H3和P815后，后者細胞過敏介質釋放率、Annexin V陽性率和脫顆粒率均高于前者細胞，后者活化后脫顆?，F象出現更早、程度更高?？梢钥闯?，P815細胞較RBL-2H3細胞在脫顆粒的研究中靈敏度更高，可作為一種早期TCMIs過敏反應評價模型。

馮宇飛等[38]通過建立大鼠腹腔肥大細胞（rat per-i onealmast cells， RPMC）模型研究SHLI類過敏反應，結果顯示RPMC脫顆粒實驗指標變化不明顯，提示組方中的3種主要有效成分與類過敏反應無直接關系。

3.1.2? 人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）? Han等[39]建立了將HUVEC單層與SHLI（0.05、0.1或0.15 mg/mL）一起孵育，以內皮通透性和細胞骨架的變化為觀察指標，并結合蛋白質印跡分析的方法，發現SHLI可誘導產生類過敏反應。

3.2? 動物模型

類過敏研究主要用到的實驗動物有Beagle犬、大鼠、小鼠、豚鼠等[40]，不同品種或品系的動物的類過敏反應易感性和表現不同[41]。

3.2.1? 大鼠? 大鼠皮膚類過敏試驗敏感、可靠，適宜于注射劑臨床前類過敏反應評價。目前大鼠的類過敏反應評價指標主要是藍斑直徑、藍斑直徑結合伊文思藍（evens blue，EB）滲出量，也可以選定皮膚藍斑OD與對照部位皮膚藍斑OD比值（K）作為評定標準[42]。梁愛華等[43-44]建立了基于改良Miles Assay法的大鼠皮膚類過敏模型，給大鼠皮內注射不同稀釋度的紫杉醇注射液和鹽酸胺碘酮注射液，尾靜脈注射指示劑EB，皮內藍斑直徑和EB滲出量結果顯示2種注射劑均可使皮膚形成較大范圍的藍斑，提示可引起類過敏反應，與臨床結果具有很好的一致性。陳桂榮等[45]創新性地將iTRAQ蛋白組學技術研究結合BN大鼠類過敏反應模型，從蛋白質組學角度成功鑒定出7個C48/80誘導類過敏反應的候選生物標志物。

3.2.2? 小鼠? 建立小鼠類過敏反應模型時，通常采用血管通透性實驗，根據耳廓藍染動物數、耳廓藍染發生率、腹部黏膜藍斑和EB滲出量來綜合評價類過敏反應強度[9]。張宇實等[46]以耳廓藍染發生率和EB滲出量作為TCMIs類過敏反應評價指標，比較不同品系、年齡的小鼠的敏感性。結果顯示，ICR敏感度最高，昆明小鼠次之，BALB/C和C57小鼠敏感性較低，提示可選用前2種小鼠作為模型動物。此外，雄性小鼠對類過敏實驗更為敏感。易艷等[47]建立ICR小鼠類過敏模型結合液質聯用成功分離出并確定連翹酯苷A是SHLI的主要類致敏成分之一。練雪萍開展了人參皂苷Rd致小鼠急性類過敏反應研究，結合代謝組學研究成功鑒定出共20個可能與類過敏有關的差異代謝物[48]。

3.2.3? 豚鼠? 梁愛華等[49]建立了TCMIs類過敏豚鼠模型，該模型證明了吐溫-80是主要的類致敏物質，靜注含吐溫-80的受試藥物的豚鼠，會發生耳廓血管通透性增高，且反應呈劑量依賴性，而注射不含吐溫-80的受試藥物的豚鼠，未發生該反應。

3.2.4? Beagle犬? 梁愛華等[50]用Beagle犬進行TCMIs的類致敏試驗發現Beagle犬對吐溫-80具有高敏感度，其首次注射0.5%吐溫-80和含吐溫-80魚腥草注射液后很快出現皮膚局部紅腫、瘙癢，精神狀態變差，血壓降低、呼吸和心率加快等與臨床上人的類過敏反應相似的癥狀，提示Beagle犬可作為臨床前評價TCMIs類過敏反應動物模型，該模型靈敏度高、重復性好、與臨床具有高度一致性。李漢成等[51]考慮到臨床患者的狀態，建立了環磷酰胺致免疫低下Beagle犬模型，通過比較免疫低下與正常Beagle犬在靜脈注射腫節風注射液后的類過敏反應，發現30 min內免疫低下組HIS含量升高較正常組顯著，即免疫低下組類過敏反應強度大于正常對照組，結果提示該模型的建立有效。

4 討論

4.1? TCMIs主要是通過直接或間接刺激MC脫顆粒而致敏，目前有關機制的研究大多停留在MC脫顆粒及介質釋放。然而，TCMIs類致敏機制是多成分多靶點多環節的。在TCMIs進入人體后至刺激MC的過程中，致敏性是源自其組分自身，還是源自其組分進入機體內反應生成的新物質，MC的激發通路是由類致敏性成分直接刺激還是涉及一個或多個通路間接刺激，這些問題值得重度與深度的研究。

4.2? TCMIs引發的類過敏反應涉及到體內外多環節的因素，由于體外的制劑、用藥等環節的因素皆為可控因素，而藥物類致敏成分的復雜性、不穩定性，以及成分進入機體內部引發類過敏所發生的各種復雜反應才是目前的研究難點，因此應嚴格規范其制備工藝與臨床合理用藥，降低其在臨床使用中的不良反應發生率，以便更全面研究TCMIs在體內引起類過敏反應的原因。如吐溫-80仍在作為輔料用于一部分現存TCMIs，存在極大的安全隱患，可嘗試尋找其他安全性高的輔料替代，以降低其類過敏發生風險。

4.3? 目前已探索出多種細胞、動物類過敏反應模型，通過這些模型成功確定了多種TCMIs的類致敏原，并推出了相關類致敏通路和機制。然而，我國的《中藥、天然藥物免疫毒性（過敏性、光變態反應）研究技術指導原則》[52]中迄今尚未制定關于類過敏試驗的指導原則，有關評價方法仍然缺乏，實驗中的觀察指標缺乏客觀性，不利于TCMIs的臨床應用與發展。因此，有必要修訂和完善類過敏試驗的評價標準及指導原則。此外，由于種屬差異性和藥物性質差異等，體外細胞模型并不能完全預測TCMIs類過敏反應。如藥物濃度和細胞毒作用影響RBL-2H3細胞導致檢測結果產生偏差;致敏性成分檢測結果呈假陰性，非致敏性成分檢測結果呈假陽性等。大多數研究是通過單一模型對單成分的單通路類致敏反應檢測，對于這些成分多以是否具有致敏性的研究為主，研究結果具有局限性。受練雪萍、劉曉娟等[48，53]的研究的啟發，可以推測TCMIs進入生物系統后，起效（毒）的可能是復方中的原形成分或代謝產物，或是與機體作用形成的新成分（可能涉及到機體能量代謝、分子信號傳導或免疫炎癥反應等方面），三者構成體內中藥成分的代謝物組，進而通過多靶點、多系統綜合干預人體內源性代謝物組來起作用，致使機體發生類過敏反應。因此，在進行TCMIs的安全性評價時，可以先基于體外MC模型進行早期的TCMIs類致敏性評價，并找出其一級致敏通路，同時建議研究時參考臨床劑量，設多個濃度組，再根據TCMIs的有效成分、輔料的性質特點，結合前期的研究資料，選用較為敏感的動物模型，進行體內類致敏試驗，深入蛋白質組學、代謝組學等研究，嘗試多種方法相聯合全面探索出類過敏反應作用機制。本課題組基于此，現已開展基于代謝組學的中藥注射劑類致敏成分與機制的研究工作。此外結合臨床建立不同免疫狀態的動物模型來評價TCMIs類致敏性也值得研究。

5 展望

TCMIs作為中藥發展進程的一個重要里程碑，其安全性問題已成為公眾關注的焦點，急需基于現有的研究基礎，更系統性地篩查類致敏原，推測作用通路，明確類致敏作用機制，以期盡早實現TCMIs類過敏反應風險評價與防控新方法的建立。這將對TCMIs的臨床用藥安全意義重大。

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（本文編輯? 匡靜之）