血府逐瘀湯對肺纖維化大鼠肺組織上皮間質轉化的影響及其機制研究

武運邦 謝 紅 王金義 肖開蘋 潘欣陽 楊邯捷 趙惠亮 渠景連

貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025

肺纖維化(Pulmonary Fibrosis，PF)是一種多病因且發病機制不明確的肺部疾病，其主要病理變化是初期的彌漫性肺泡炎和后期的成纖維細胞增殖、轉化以及細胞外基質的過度沉積[1]。其中，肺泡上皮細胞的易損性、異常重塑、表型改變是肺纖維化發生的關鍵[2]。上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)是上皮細胞向間質表型轉化的過程，在這一過程中，上皮細胞標志物如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)逐漸丟失，而間質細胞標志物如α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達升高[3]。研究表明，EMT與肺纖維化密切相關，它被證明是肌成纖維細胞的主要來源，而肌成纖維細胞通過分泌細胞外基質參與組織纖維化[4]。在EMT過程中，轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)信號通路被激活，Smad3作為TGF-β信號通路中一個重要的組成部分，對于TGF-β1介導的EMT極其重要[5]。

中醫學理論認為肺纖維化的病變實質是“肺絡瘀滯”，故活血化瘀通絡是該病的主要治法。血府逐瘀湯出自于清代醫家王清任《醫林改錯》，是活血化瘀的代表方劑。臨床研究表明，血府逐瘀湯對肺纖維化的抑制與改善作用明顯[6-7]，關于該方藥理作用的研究也逐漸增多，但尚未見從EMT角度進行研究的報道。本研究以EMT為切入點，探討血府逐瘀湯對PF模型大鼠肺組織EMT的影響，并從TGF-β1/Smad3出發進一步分析其可能機制，以期為闡明該方防治PF的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠48只，雄性，體質量(200±20)g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：SCXK(湘)2014-0011。

1.2 藥物與試劑 血府逐瘀湯由桃仁、川芎、桔梗、赤芍、枳殼、甘草、柴胡、紅花、當歸、生地黃、牛膝組成，藥物購自貴陽同仁堂藥房。其中：桃仁(批號：170401，產地：山東)；川芎(批號：170701，產地：安徽)；桔梗(批號：170301，產地：安徽)；赤芍(批號：170401，產地：內蒙古)；枳殼(批號：170401，產地：江西)；甘草(批號：180301，產地：新疆)；柴胡(批號：170301，產地：山西)；紅花(批號:171201，產地：新疆)；當歸(批號：170701，產地：甘肅)；生地黃(批號：171201，產地：河南)；牛膝(批號：170401，產地：河南)。分別煎制濃縮為含生藥0.351、0.702、1.404 g·mL-1的合劑，每次制備3 d藥量，4 ℃冰箱保存備用。

醋酸地塞米松片(批號：151238，浙江仙琚制藥股份有限公司)；博來霉素(批號：16032311，海正輝瑞制藥有限公司)；α-SMA抗體(一抗，兔源，批號：AG02247616，北京博奧森生物技術公司)；Smad3抗體(一抗，兔源，批號：GR3190902-12，英國abcam公司)；TGF-β1抗體(一抗，兔源，批號：55e6713，Affinity公司)；E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(一抗，兔源，批號：18k0657，Affinity公司)；β-actin抗體(一抗，小鼠源，批號：48k2671)、山羊抗兔辣根過氧化酶標記二抗(批號：3825j63)、山羊抗小鼠辣根過氧化酶標記二抗(批號：1292k61)均購自美國Affinity Biosciences公司；Mayer蘇木素染液(批號：20170526)、DAB顯色試劑盒(批號：20170511)均購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒(批號：SE248353，美國Thermo Scientific公司)；ECL發光液(批號：1716501)、PVDF膜(批號：MB0323)均購自默克密理博有限公司。

1.3 主要儀器 Allegra X-30R離心機(美國BECKMAN公司)；GNP-9080隔水式電熱恒溫培養箱(蘇州威爾實驗用品有限公司)；1150H石蠟包埋機(德國Leica公司)；RM2265輪轉切片機(德國Leica公司)；PL303電子天平(梅特勒-托利多儀器公司)；BX 53顯微圖像采集系統(日本OLYMPUS公司)；PowerPacTMBasic電泳儀(美國Bio-Rad公司)；ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統(美國Bio-Rad 公司)等。

2 方法

2.1 動物分組及模型制備 將大鼠常規適應性飼養7d后，隨機分為6組：正常組、模型組、地塞米松組、血府逐瘀湯高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組均采用氣管滴注博來霉素復制PF模型[8]：用10%水合氯醛 3 mL·kg-1麻醉大鼠后，頸部皮膚消毒，剪去頸部鼠毛，行頸正中切口，分離暴露氣管。經氣管軟骨環間隙向心端穿刺注入博來霉素5 mg/kg，在注射過程中必須非常緩慢的注入，并且邊注射邊觀察大鼠胸廓的起伏，防止堵塞氣道，導致大鼠的死亡。注射完成后立即將動物直立并旋轉，使藥液在肺內分布充分、均勻，然后縫合皮膚。正常組動物在同樣條件下注入等量生理鹽水。術后讓大鼠自由飲水、進食。

2.2 給藥 造模后第2 d開始每天灌胃給藥，正常組和模型組予蒸餾水溶液(10 mL·kg-1·d-1)；地塞米松組予等容積地塞米松蒸餾水溶液(0.000405 g·kg-1·d-1)；血府逐瘀湯高劑量組(14.04 g·kg-1·d-1)、血府逐瘀湯中劑量組(7.02 g·kg-1·d-1)和血府逐瘀湯低劑量組(3.51 g·kg-1·d-1)分別給予等容積藥液。每日灌胃1次，連續給藥28 d。

2.3 標本采集 治療后第28 d，以10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠，股動脈放血后剖取兩肺，剪除氣管、支氣管，將左肺組織用冰鹽水沖洗3遍，濾紙吸干水分，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，常規脫蠟，用免疫組化法檢測肺組織上皮細胞標志物(E-cadherin)和間質細胞標志物(α-SMA)的表達水平。右肺分裝于1.5 mL EP管，轉存-80 ℃冰箱凍存，用蛋白免疫印跡法(Western blot)觀察各組肺組織中TGF-β1 和Smad3的蛋白表達變化。

2.4 免疫組化法檢測肺組織中E-cadherin和α-SMA的表達 將石蠟切片放于60 ℃烤箱中2 h；二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各2 min脫蠟至水；3%H2O2室溫滅活10～15 min；PBS沖洗3次/5分鐘；抗原熱修復10 min，冷卻至室溫；PBS沖洗3次/5分鐘；滴加封閉液5% BSA，滴加一抗，4℃孵育過夜；PBS沖洗3次/5 min；滴加二抗，濕盒內37 ℃孵育1 h，PBS沖洗3次/5 min；DAB顯色，蘇木素核復染，梯度乙醇逐步脫水，二甲苯進行透明，最后用中性樹膠封片。光學顯微鏡下隨機觀察5個視野、拍照，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統測定每個視野陽性細胞的平均光密度值，以此反映相應蛋白的表達水平。

2.5 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肺組織中TGF-β1和Smad3的表達 取大鼠右肺上葉肺組織100 mg，加入1 mL預冷的裂解液，用電動勻漿器在冰上勻漿，于4 ℃下以12000 r·min-1離心20 min，收集上清液；取少量上清液進行蛋白定量；剩下的加入等體積2×上樣緩沖液，95℃水浴煮5 min后于-80 ℃冰箱保存，備測。取上述蛋白適量進行SDS-PAGE電泳(電壓100 V，時間1.5 h)，電泳結束后轉移至PVDF膜后，于5%脫脂奶粉中封閉1 h；分別加入一抗溶液(TGF-β1、Smad3兔單克隆抗體，稀釋度為1∶5000)孵育，4℃ 孵育過夜；取出PVDF膜，TBST洗3次；加入二抗常溫孵育1 h，取出PVDF膜，TBST洗3次，經ECL顯色后于凝膠成像系統中顯影；采用ImageJ 1.51K軟件進行分析，以目的蛋白與內參β-actin的灰度值比值表示相應蛋白的表達水平。

3 結果

3.1 血府逐瘀湯對肺纖維化大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA表達的影響 模型組大鼠肺組織E-cadherin表達顯著低于正常組(P<0.01)，而α-SMA表達顯著高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織E-cadherin表達均顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而α-SMA表達顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的E-cadherin表達顯著降低(P<0.05)，而α-SMA表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1和圖2。

表1 血府逐瘀湯對肺纖維化大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA表達的影響

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

3.2 血府逐瘀湯對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達的影響 模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達顯著高于正常組(P<0.01)。與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織TGF-β1、Smad3表達均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的TGF-β1、Smad3表達顯著升高(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 血府逐瘀湯對肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達的影響

A.正常組；B.模型組；C.血府逐瘀湯高劑量組；D.血府逐瘀湯中劑量組；E.血府逐瘀湯低劑量組；F.地塞米松組

4 討論

PF是肺組織受損后人體自身修復的結果，也是以成纖維細胞增殖以及細胞外基質過度沉積并伴炎癥損傷、組織結構破壞為特征的多種肺部疾病的最終結局。臨床主要表現為干咳、進行性呼吸困難，且隨著病情加重，呼吸功能不斷惡化，嚴重影響患者的生活質量。如前所述，EMT是上皮細胞在形態學上發生間充質細胞表型的轉變，其在PF和肌成纖維細胞活化的發展中起關鍵作用。EMT發生時，上皮細胞極性消失，上皮細胞標志物下調，細胞骨架重排，遷移和運動能力增強，同時獲得間質細胞特性，間質細胞標志物上調[3]。

研究表明，多種細胞因子參與了EMT過程，尤其是TGF-β1，是目前公認的促進EMT的核心細胞因子[9]，在此過程中，TGF-β1促進了上皮細胞表型的丟失。TGF-β1介導EMT的途徑眾多，但主要依賴Smad途徑[10]。Smad蛋白家族是一類細胞內TGF-β受體激酶的底物[11]，其本身既是轉錄因子，也是其他轉錄因子如Slug、Snail、Scatter、淋巴增強因子1、β連環蛋白等的誘導物[12]。Smad3控制一系列Smad依賴的靶基因轉錄[13]，TGF-β1受體絲氨酸-蘇氨酸激酶激活Smad2/3后，使其磷酸化，Smad3與Smad4結合形成復合物進入到細胞核，從而與其他轉錄因子共同調控靶基因的轉錄，最終導致EMT及PF的發生。Wang等[14]在博來霉素誘導的肺纖維化模型小鼠中發現，熱休克蛋白27和Smad3表達均增加，進而激活細胞外調節蛋白激酶信號通路促進EMT。

中醫學認為PF的病變實質是“肺絡瘀滯”。肺為嬌臟，外易受六淫之邪，內可生瘀血為患，諸因素均可閉阻氣機，導致肺絡之氣血運行受阻，氣血不暢，更易釀生瘀血，從而造成肺絡瘀滯而發病[15]。李菊蓮等[16]也認為本病早期毛細血管增生、擴張、充血，管壁增厚，晚期由于大量纖維結締組織增殖而收縮，毛細血管數量減少甚至閉鎖，說明PF存在肺絡瘀滯病機。“絡以通為用”，因此，治療本病當以活血通絡為主。血府逐瘀湯是王清任所創的活血化瘀五大名方之一，由桃仁、紅花、當歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡，枳殼、甘草組成。諸藥合用，不僅可行血分之瘀滯，又可解氣分之郁結，寓行氣于活血之中，寓養于行散之中，活血而不耗血，袪瘀又能生新，升降同用，使瘀血下行，氣機暢達，臟腑和調?，F代藥理研究表明，血府逐瘀湯可通過抑制Smad3、MMP-7的蛋白表達來降低肺纖維化程度[17]，此外對氧自由基損傷也有不同程度的干預作用，并可通過降低血清HA、肺組織HYP、膠原蛋白含量及提高彈性纖維含量來改善其細胞外基質代謝[18]。在此基礎上，本研究以療效較好的地塞米松為陽性對照，探討了血府逐瘀湯對PF模型大鼠肺組織中上皮細胞標志物、間質細胞標志物表達以及TGF-β1/Smad3信號通路的影響。

本研究結果顯示，模型組大鼠肺組織E-cadherin表達較正常組顯著降低，而α-SMA表達較正常組顯著升高，提示模型復制成功。給予不同劑量的血府逐瘀湯后，各給藥組大鼠E-cadherin表達顯著升高，而α-SMA表達顯著降低，表明該方可不同程度地上調E-cadherin表達，下調α-SMA表達，提示該方防治PF的作用可能與抑制EMT有關。進一步研究結果顯示，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達顯著升高，提示PF發生后TGF-β1/Smad3信號通路被激活，給予不同劑量的血府逐瘀湯后，大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達均顯著降低，提示血府逐瘀湯治療PF的機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關。此外，本研究結果還顯示，血府逐瘀湯低劑量組大鼠肺組織E-cadherin表達顯著低于地塞米松組，α-SMA、TGF-β1、Smad3表達顯著高于地塞米松組，而中、高劑量組與地塞米松組比較差異無統計學意義，提示中劑量組(7.02 g·kg-1·d-1)、高劑量組(14.04 g·kg-1·d-1)血府逐瘀湯對PF模型的改善作用與地塞米松相當。

綜上所述，血府逐瘀湯可通過干預EMT來減輕模型大鼠的肺纖維化，其機制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關，但其具體機制還有待進一步研究。