胰激肽原酶減輕單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎間質(zhì)纖維化*

金文成， 金 健， 樸尚國， 李慧瑛， 姜玉姬， 玄美英， 鄭海蘭，金吉哲， 金英順， 李 燦

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腎病學(xué)科，吉林延吉133000）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）是危害全球人類健康的主要原因之一，其發(fā)生率因肥胖、糖尿病、高血壓及長壽等原因逐年增加［1］。腎小管間質(zhì)纖維化是大多數(shù)CKD患者的最終病理表現(xiàn)，結(jié)果可導(dǎo)致終末期腎病。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）是腎小管間質(zhì)纖維化的典型模型，表現(xiàn)為腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)、細胞外基質(zhì)沉積及腎小管擴張、萎縮和纖維化的形成，其分子機制極其復(fù)雜，包括炎癥介質(zhì)、致纖因子、氧化應(yīng)激和細胞凋亡等因素的參與［2-4］。

胰激肽原酶（pancreatic kininogenase，PK）屬于絲氨酸蛋白酶，其作用于激肽原產(chǎn)生具有生物活性的激肽多肽。激肽結(jié)合緩激肽B1和B2受體通過動員細胞內(nèi)鈣離子產(chǎn)生一氧化氮、前列腺素和環(huán)磷酸腺苷等物質(zhì)從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［5］。大量研究表明組織激肽釋放酶及其轉(zhuǎn)基因?qū)Ω哐獕旱刃难芗膊　⑷毖阅X卒中、糖尿病及各種腎臟疾病具有治療作用［6-8］。近期研究表明，激肽釋放酶和激肽釋放酶轉(zhuǎn)基因可調(diào)節(jié)鏈霉素誘發(fā)的糖尿病模型中的血糖指標，并且改善脂質(zhì)代謝［6］。在糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）模型中，激肽釋放酶基因缺陷可加重鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎病中微量白蛋白尿的排出，而PK治療不僅改善血糖，而且減輕了白蛋白尿，從而改善腎纖維化［7-8］。且在慶大霉素誘導(dǎo)的腎衰竭模型［9］、腎缺血-再灌注損傷［10］、高血壓腎病［11］及多囊腎［12］等疾病中均觀察到了胰激肽原酶對腎臟的保護作用。然而，PK是否對單純UUO所致腎間質(zhì)炎癥反應(yīng)、致纖因子、氧化應(yīng)激、細胞凋亡及自噬等腎間質(zhì)纖維化有治療效果尚不明確，本實驗利用UUO大鼠模型探討PK抗腎間質(zhì)纖維化的作用機制。

材料和方法

1 動物模型與藥物治療

38只雄性SD大鼠購自延邊大學(xué)動物實驗室（實驗動物倫理編號為YBU2018-10-8），體重200～220 g，給予標準飼料和飲用水，經(jīng)1周的適應(yīng)期后隨機分為假手術(shù)（sham）組（n=6）、UUO7組（n=8）、UUO+PK7組（n=8）、UUO14組（n=8）和 UUO+PK14組（n=8）。在苯巴比妥（40 mg·kg-1·d-1）麻醉下，UUO各組經(jīng)側(cè)腹切口行左側(cè)輸尿管結(jié)扎，假手術(shù)組僅游離輸尿管后縫合皮膚。UUO7組和UUO14組大鼠經(jīng)腹腔注射PK（7.2 U·kg-1·d-1；Changzhou Qianhong Bio-pharma Co.，Ltd.），假手術(shù)組給予生理鹽水治療，于第7和14天處死大鼠（實驗中sham組第7天和14天各指標無統(tǒng)計學(xué)差異，故后續(xù)實驗采用第14天結(jié)果），UUO7組和UUO+PK7組于第7天處死大鼠，UUO14和UUO+PK14組大鼠于第14天處死大鼠。收集血液、尿液、腎組織標本以備進一步檢測。PK劑量選擇基于以往文獻報道［13］。

2 實驗試劑

抗轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β 1，TGF-β1）抗體購自R&D Systems；抗結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、超氧化物歧化酶 1（superoxide dismutase 1，SOD1）、NADPH氧化酶2（NADPH oxidase-2，NOX-2）、NOX-4、Bcl-2、Bax、LC3B、beclin-1、P62和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2/MnSOD）抗體購自Abcam；抗單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）和Toll樣受體-2（Toll-like receptor-2，TLR-2）抗體購自 Santa Cruz；抗 cleaved caspase-3抗體購自Millipore。

3 主要方法

3.1 血、尿8-羥脫氧鳥苷（8-hydroxydeoxyguanosine，8-OHdG）水平的測定 根據(jù)試劑盒操作步驟用ELISA法測定血、尿8-OHdG DNA加合物水平。

3.2 腎臟病理組織檢查 各組大鼠腎組織由過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛液（periodate-lysine-para formaldehyde solution，PLP）固定，石蠟包埋后切片，行Masson三色染色和HE染色，采用數(shù)字化顯微鏡分析儀（TDI Scope Eye Version 3.5 for Windows，Olympus）于高倍鏡視野下分析腎小管間質(zhì)纖維化（tubulointerstitial fibrosis，TIF）程度。每個標本至少觀察20個非重疊區(qū)域取平均數(shù)［14］。

3.3 免疫組織化學(xué)染色 免疫組化步驟簡述如下：石蠟包埋切片置于二甲苯脫蠟，梯度乙醇中脫水，37℃下采用0.3%過氧化氫/甲醛處理30 min后，采用PBS液洗3次。置于微波爐中加熱行波爐抗原修復(fù)（98℃，5 min）。室溫下采用非免疫性血清封閉20 min。4℃下滴加抗ED-1單克隆抗體和抗osteopontin（OPN）抗體孵育12～16 h。PBS液洗3次后滴加Ⅱ抗，室溫孵育2 h。以DAB為底物顯色，呈棕黃色為止。自來水流水洗滌，復(fù)染蘇木素，常規(guī)樹脂封片。染色程度采用數(shù)字化顯微鏡分析儀（TDI Scope Eye?Version 3.0 for Windows，Olympus）中的Polygon 程序算出每0.5 mm2染色面積的陽性表達百分比。

3.4 TUNEL法檢測細胞凋亡情況 根據(jù)ApopTag?in Situ Apoptosis Detection Kit（Millipore）試劑盒操作步驟測定細胞凋亡，200高倍下采用數(shù)字化顯微鏡分析儀計數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)。

3.5 電鏡觀察 腎皮質(zhì)組織置于二甲胂酸鈉溶液配制的戊二醛固定液中固定48 h，PBS沖洗3次，1%鋨酸固定2 h，雙蒸水沖洗，常規(guī)脫水、環(huán)氧樹脂定向包埋，LKB-V型超薄切片機先行半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡定位后行超薄切片，厚50～70 nm，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，1200EX（JEOL）型透射電鏡觀察。

3.6 Western blot實驗 稱取-80℃凍存的腎臟組織50～60 g（冰上操作）于1.5 mL的EP管中，加入500μL細胞裂解液（RIPA裂解液、PMSF和蛋白酶抑制劑復(fù)合物，現(xiàn)用現(xiàn)配），剪碎研磨，充分裂解30 min，之后于4℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型）測定蛋白濃度。行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)膜2 h后，4℃下置I抗于非脂牛乳中以1∶1 000濃度孵育12～16 h，PBS緩沖液洗3次后加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG（Amersham）孵育1 h，PBS緩沖液洗3次，增強發(fā)光（ECL?，Amersham）并曝光。計算目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的相對吸光度值的比值，對照組為標準（100%）測定條帶，以β-actin為內(nèi)參照。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni post hoc校正，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PK減少UUO所致腎間質(zhì)纖維化

肉眼可見UUO導(dǎo)致大鼠腎臟增大、腎盂擴張積水、皮質(zhì)變薄，這種改變在UUO第14天尤為明顯，見圖1A。Masson染色和HE染色提示主要病變位于腎小管間質(zhì)，表現(xiàn)為腎小管壞死、空泡形成、小管基底膜增厚、炎癥細胞浸潤、腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化，見圖1B、1C；電鏡檢查清昕可見萎縮的、空泡變性的小管及束狀膠原纖維在腎間質(zhì)的沉積（圖1D）。與sham組相比，UUO7組大鼠腎間質(zhì)纖維化程度明顯增加（P＜0.01），UUO14組明顯高于 UUO7組（P＜0.05），UUO+PK7組與UUO+PK14組腎間質(zhì)纖維化程度分別明顯低于UU07組和UU014組（P＜0.05），定量計分系統(tǒng)分析表明PK可明顯減少腎間質(zhì)纖維化程度，且呈時間依賴性，見圖1E。Western blot結(jié)果示，與sham組相比，UUO7組TGF-β1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），UUO14組TGF-β1蛋白表達水平較UUO7組進一步升高（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組TGF-β1蛋白表達水平分別均較UUO7組和UUO14組明顯降低（P＜0.05）；CTGF及MMP2蛋白表達結(jié)果與TGF-β1蛋白表達結(jié)果相仿，結(jié)果示PK抑制UUO所致的TGF-β1、CTGF和MMP2的高表達，見圖2。

2 PK減輕UUO所致的炎癥反應(yīng)

免疫組化結(jié)果顯示，UUO導(dǎo)致大量的ED-1陽性細胞在腎間質(zhì)浸潤和炎癥介質(zhì)OPN的高表達（P＜0.05），PK治療分別在UUO第7和14天均顯著減少ED-1陽性細胞數(shù)和OPN的表達（P＜0.05），見圖3A、B、D、E。另外，Western blot結(jié)果顯示與sham組相比，UUO7組MCP-1蛋白表達水平明顯升高（P＜0.01），UUO14組的MCP-1蛋白表達水平明顯高于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組MCP-1蛋白表達水平較UUO7組或UUO14組均明顯降低（P＜0.05），TLR-2蛋白表達結(jié)果與MCP-1蛋白表達結(jié)果大致相仿，說明PK下調(diào)MCP-1和TLR-2的表達且呈時間依賴性，見圖4。

3 PK減輕UUO所致氧化應(yīng)激

與sham組相比，UUO7組SOD1和SOD2蛋白表達水平明顯降低（P＜0.01），UUO14組SOD1和SOD2蛋白表達水平明顯下降于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組SOD1和SOD2蛋白表達水平分別較UUO7組和UUO14組均明顯升高（P＜0.05）。反之，NOX-2和NOX-4表達結(jié)果可見，與sham組相比，UUO7組及UUO14組NOX-2和NOX-4蛋白表達水平明顯升高，且隨UUO時間遞增（P＜0.05），而 UUO+PK7組與 UUO+PK14組 NOX-2和NOX-4蛋白表達水平分別較UUO7組和UUO14組均明顯下降（P＜0.05）。Western blot結(jié)果表明PK通過增加SOD1和SOD2的表達，減少NOX-2和NOX-4的表達，保持氧化酶和抗氧化酶的平衡，見圖5A。此外，本研究發(fā)現(xiàn)8-OHdG在大鼠血、尿中的含量隨UUO時間遞增（P＜0.05），PK治療減少大鼠血、尿8-OHdG的含量（P＜0.05），見圖5B。

4 PK減少UUO所致細胞凋亡

Figure 1.The pathological changes of kidney of rats in each group.Representative imagess of the kidney under gross observation（A），the photomicrographs of Masson trichrome staining（B）and HE staining（C），the images of transmission electron microscopy（D），and the quantitative analysis of tubulointerstitial fibrosis（E）were observed.D1：normal kidney structure in the sham-operated group（×10 000）；D2：tubular vacuolization and atrophy of obstructed kidney（×20 000）；D3：collagenous fiber deposition within the tubulointerstitium of obstructed kidney（stars，×30 000）；D4：tubular basement membrane thickening（arrows）and scattered interstitial collagen deposition（star，×30 000）；D5：swelling of the tubulointerstitium（ring）and inflammatory cell infiltration（arrowheads，×20 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖1 各組大鼠腎臟組織的病理變化

Figure 2.The effect of PK on the protein expression of fibrogenic cytokines of kidney in rats was dtected by Western blot analysis.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖2 Western blot法分析胰激肽原酶對大鼠腎臟組織中致纖因子蛋白表達的影響

Figure 3.The representative photomicrographs of immunohistochemistry for ED-1（A）and OPN（B）and transmission electron microscopy（C）with quantitative analysis（D and E）.C1：the inflammatory cell infiltration within tubulointerstitium（arrows，×10 000）；C2：the inflammasome（arrowhead，×30 000）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖3 免疫組化和電鏡檢測各組大鼠腎臟組織中炎癥介質(zhì)和炎癥細胞浸潤

Figure 4.The effect of PK on the protein expression of inflammatory cytokines of kidney in rats was detected by Western blot analysis.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖4 Western blot法分析胰激肽原酶對大鼠腎臟組織中炎癥介質(zhì)表達的影響

細胞凋亡參與了UUO腎損傷過程，高倍顯微鏡下可以觀察到大量的TUNEL陽性細胞，利用電鏡可清晰地觀察到細胞核濃縮的凋亡小體，見圖6A1，PK治療不僅改善了腎間質(zhì)纖維化，且減少了TUNEL陽性細胞數(shù)（P＜0.05），見圖6A。在分子水平上，細胞凋亡調(diào)控因子Bcl-2/Bax比值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，UUO7組 Bcl-2/Bax水平明顯降低（P＜0.01），UUO14組Bcl-2/Bax水平明顯下降于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組Bcl-2/Bax比值結(jié)果分別較UUO7組和UUO14組均明顯升高（P＜0.05）。與sham組相比，UUO7組活化型caspase-3的水平明顯升高（P＜0.01），UUO14組活化型caspase-3的水平明顯高于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組活化型caspase-3的水平分別較UUO第7和14天均明顯降低（P＜0.05），見圖6B。

Figure 5.The representative images of Western blot analysis of a series of oxidative stress-related proteins（A），and serum and urine concentrations of 8-OHdG（B）were showed.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖5 Western blot分析氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達及血、尿8-OHdG水平的分析

5PK減少UUO所致細胞自噬

電鏡下可清晰觀察到各種細胞自噬衍生物，如脂滴（圖7A1）、髓樣物（圖7A2）、溶酶體（圖7A3）和自噬體（圖7A4）。采用Western blot法檢測細胞自噬調(diào)控因子的表達，在分子水平上，細胞凋亡調(diào)控因子LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與sham組比較，UUO7組表達水平明顯升高（P＜0.01），UUO14組表達水平明顯高于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組相關(guān)比值結(jié)果分別較UUO7組和UUO14組均明顯下降（P＜0.05）。與sham組相比，UUO7組 beclin-1表達水平明顯升高（P＜0.01），UUO14組beclin-1表達水平明顯高于UUO7組（P＜0.05），而UUO+PK7組與UUO+PK14組beclin-1表達水平分別較UUO第7和14天明顯降低（P＜0.05），P62表達結(jié)果與beclin-1蛋白表達結(jié)果大致相仿。結(jié)果提示PK可顯著下調(diào)UUO所致LC3B、beclin-1和P62的高表達，見圖7B。

討 論

Figure 6.The effect of PK on apoptosis induced by UUO was detected by TUNEL staining（A），transmission electron microscopy（A1）and Western blot analysis（B）.Apoptotic body was shown in A1（arrow，×30 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖6 TUNEL染色、電鏡觀察和Western blot分析PK對UUO所致細胞凋亡的影響

Figure 7.The effect of PK on autophagy was detected by transmission electron microscopy（A）and Western blot analysis（B）.A1：scattered lipid droplets（lipophagy，stars，×10 000）；A2：myelin body（red arrows，×20 000）；A3：autolysosome formation（blue arrows，×30 000）；A4：autophagosome formation（ring，×10 000）.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs sham group；#P＜0.05 vs UUO7 group；$P＜0.05 vs UUO14 group.圖7 電鏡觀察和Western blot分析PK對UUO所致細胞自噬的影響

研究表明，PK在心肌梗死、脈絡(luò)膜新生血管性疾病及各種腎臟疾病中可抑制MCP-1和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等炎癥介質(zhì)的表達、減少炎癥細胞的浸潤、下調(diào)TGF-β1的表達、防止細胞外基質(zhì)的沉積，說明PK具有抗炎和抗纖維化的作用［13，15-16］。為揭示PK是否對UUO所致的腎間質(zhì)纖維化也具有相同作用，本研究建立UUO大鼠模型，分別在7 d和14 d觀察PK對UUO所致腎損傷的作用。結(jié)果表明PK可明顯下調(diào)炎癥介質(zhì)MCP-1、TLR-2、OPN及致纖因子TGF-β1和CTGF的表達，繼之減少炎癥細胞浸潤（ED-1陽性細胞數(shù)）和基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的沉積。本研究結(jié)果與Bledsoe等［9］和Liu等［7］在慶大霉素腎毒性和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病腎病模型中PK所發(fā)揮的腎保護作用機制極為相似，提示PK通過抑制炎癥介質(zhì)和致纖因子的表達對UUO腎損傷發(fā)揮抗炎和抗纖維化的保護作用。

目前推測至少2種因素參與PK發(fā)揮抗炎和抗纖維化的保護作用。首先是氧化應(yīng)激，眾所周知UUO歸根結(jié)底引起梗阻腎的缺血缺氧，其結(jié)果是以氧化酶活性增高和抗氧化酶活性下降為特點的氧化應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化［17-18］，這種推斷被許多研究所證實，譬如使用抗氧化劑維生素E治療或環(huán)氧化物酶基因敲除小鼠表現(xiàn)為較輕的腎間質(zhì)纖維化［19-20］。在糖尿病心肌病模型中，PK通過抗氧化作用減少肌纖維變性和間質(zhì)膠原沉積［21］。類似地，PK減少糖尿病腎病小鼠的腎小球基底膜增厚和腎纖維化［7］；其次是細胞凋亡（Ⅰ型程序性細胞死亡），大量研究表明細胞凋亡在UUO所致的腎間質(zhì)纖維化中扮演著重要角色［22］，理由是UUO可直接誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡［23］或間接通過氧化應(yīng)激或TGF-β1誘導(dǎo)腎實質(zhì)細胞凋亡［24-25］。因此，氧化應(yīng)激、TGF-β1和細胞凋亡3者間有著相互關(guān)聯(lián)、相互影響的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，PK減少了血清和尿液中8-OHdG的水平，保持了氧化酶（NOX-2和NOX-4）及抗氧化酶（SOD1和SOD2）蛋白表達的平衡，趨于減弱氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)了細胞凋亡調(diào)控基因的表達、減少了TUNEL陽性細胞數(shù)。綜上所述，PK減輕UUO所致腎間質(zhì)纖維化與其抗氧化應(yīng)激和抗細胞凋亡效應(yīng)緊密相關(guān)。

除氧化應(yīng)激和細胞凋亡外，細胞自噬（Ⅱ型程序性細胞死亡）在UUO所致腎間質(zhì)纖維化進展中也起到關(guān)鍵作用。細胞自噬是通過降解受損的細胞質(zhì)成分的一種細胞內(nèi)自我防御過程，被生理性和病理性刺激所激活，尤其是細胞在缺氧和應(yīng)激狀態(tài)下。已知在UUO模型中，遺傳性敲除遠端小管Atg7基因或利用藥物阻斷細胞自噬可以加重腎間質(zhì)纖維化程度，提示細胞自噬具有保護性作用［26-27］。然而，過度的細胞自噬恰恰相反，屬于病理過程，它促進致纖因子的高表達，產(chǎn)生和堆積細胞外基質(zhì)，使肌成纖維細胞分化、細胞凋亡、線粒體損傷，最終形成纖維化［28-29］。因此，細胞自噬發(fā)揮著雙重作用，即使是在同一模型中，細胞血管的作用也取決于細胞的種類、細胞間復(fù)雜的“cross-talk”和模型中動物的血統(tǒng)。在本研究中，通過電鏡檢查清晰地觀察到梗阻腎組織中存在大量的細胞自噬衍生物，包括脂滴、髓樣物、溶酶體和自噬體等，PK治療后這些物質(zhì)明顯減少。Western blot結(jié)果表明PK抑制細胞自噬調(diào)控因子（LC3B、beclin-1和P62）的高表達。因此，在本實驗中細胞自噬參與了腎間質(zhì)纖維化過程，而PK有效地防止纖維化與干預(yù)細胞自噬有關(guān)。

減少慢性腎臟病的發(fā)生有著重要的臨床意義，其宗旨是改善人們的生活質(zhì)量、減少社會的經(jīng)濟負擔(dān)。臨床上PK是血管擴張藥物，主要應(yīng)用于微循環(huán)障礙性疾病，尤其是糖尿病患者的周圍神經(jīng)病變。本研究利用臨床常用藥、采用多種檢測手段，闡明了PK對UUO所致腎間質(zhì)纖維化具有抗炎和抗纖維化作用，抑制氧化應(yīng)激和程序性細胞死亡是其發(fā)揮腎臟保護作用的分子機制，這為臨床上推廣PK廣泛應(yīng)用提供了有力的理論依據(jù)。