氧化應激和炎癥反應在甲狀腺功能亢進小鼠腎損傷中的作用*

靳貝芳， 盧欽鎮， 張 妍， 崔亞嵐， 強 鄭， 廖蔓茜， 譚慧源， 劉 昉，3△

（桂林醫學院 1基礎醫學院人體解剖學教研室，2臨床醫學院，3廣西糖尿病系統醫學重點實驗室，廣西桂林541004）

甲狀腺功能亢進癥（甲亢）是內科疾病中常見且多發的內分泌相關疾病，由機體合成和分泌過多的甲狀腺激素所引起。近年來甲亢發病率呈上升趨勢，且女性發病遠高于男性，已成為內分泌科僅次于糖尿病的第二大疾病［1］。甲亢會對全身系統造成損傷，其對腎臟的損傷已引起人們的重視［2］。有研究證明，血液中過量的甲狀腺激素可通過直接或間接作用影響腎臟生長發育，造成腎結構和功能損傷，但其中的機制尚不完全清楚［3］。

4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）是脂質過氧化醛基產物中的典型物質，也是氧化應激的關鍵調節者［4-5］，其過量積聚會對細胞產生不可逆轉的損傷，終究導致細胞凋亡或壞死等毒性反應。之前有文獻報道，4-HNE在調節腎臟病中發揮重要作用，但研究主要集中在糖尿病引發的腎病綜合征中［6］，而4-HNE是否可調節甲亢誘發的腎臟病尚不清楚。

白細胞介素1受體相關激酶1（interleukin-1 receptor-associated kinase 1，IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptorrelated factor 6，TRAF6）是炎癥調控的重要因子，我們之前的研究證明了IRAK1和TRAF6在調節甲亢性心臟病中作用突出［7］，但在甲亢性腎臟病中是否同樣具有調控作用仍需進一步研究。

因此本研究采用腹腔注射過量甲狀腺素（L-thyroxine，T4）的方法建立甲亢小鼠模型，觀察T4處理對小鼠腎臟產生的影響，進一步從氧化應激和炎癥反應方面探究甲亢造成腎損傷的機制，為臨床干預甲亢性腎損傷提供參考。

材料和方法

1 實驗材料

40只6～8周健康清潔級，體重30 g左右的雄性昆明種小鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號為SCXK（湘）2016-0002。T4（T2376）購自Sigma-Aldrich；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（A001-3）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（A003-1）購自南京建成；抗4-HNE抗體（ab46545）和抗TRAF6抗體（33915）購自Abcam；抗IRAK1抗體（4504S）和抗β-tubulin抗體（2146S）購自CST；II抗（ZB2301）和DAB顯色試劑盒（ZLI-9081）購自中杉金橋；ECL發光液（P10110）購自新賽美公司；其他生物試劑使用國產試劑。

2 方法

2.1 動物模型的建立 將6～8周雄性昆明小鼠適應性（適應環境、溫度變化）飼養1周后，隨機分為甲亢模型組（T4組）和對照組，每組20只。T4組小鼠按1 mg/kg的劑量腹腔注射T4稀釋液，隔天注射1次，連續給藥7周以建立甲亢模型；對照組小鼠采用相同的方法注射等體積的生理鹽水。T4稀釋液配制：取適量T4粉末溶于含0.01 mol/L NaOH和0.1%牛血清白蛋白的溶液中，配制成2 g/L的T4母液，4℃避光保存，使用時用生理鹽水將母液稀釋10倍得到T4稀釋液。造模結束后解剖小鼠，進行腎臟取材及脛骨長度測量。用濾紙吸干水分對右側腎臟進行拍照并稱重，以右腎重量（mg）與小鼠體重（g）的比值作為腎臟肥大指數。右腎還用于組織切片實驗，固定于4%多聚甲醛中；左腎則用于Western blot實驗，凍于-80℃冰箱。

2.2 HE染色 將右腎組織石蠟包埋后，切成4μm的切片，將切片脫蠟至水，進行常規HE染色，中性樹膠封片，400倍視野下觀察腎組織結構和病理變化。

2.3 腎組織SOD活性和MDA含量的測定 準確稱取小鼠右側新鮮腎組織，按腎臟重量（g）∶勻漿液體積（mL）=1∶9的比例加勻漿液，研磨制備勻漿，4℃、3 000 r/min離心10 min，取上清總蛋白待測。根據試劑盒說明書操作，SOD和MDA分別在450 nm和532 nm處讀取各孔吸光度（A）值，根據相應公式分別計算腎組織中SOD活性和MDA含量。

2.4 Western blot實驗 將腎組織放入RIPA裂解液中（含蛋白酶抑制劑），冰上進行充分研磨裂解后，4℃、10 000 r/min離心10 min，取上清即總蛋白。使用BCA法測定蛋白濃度，加入loading buffer使蛋白變性。蛋白經SDS-PAGE分離，之后轉至PVDF膜上，在室溫下用5%脫脂奶粉搖床封閉1 h。加I抗（抗4-HNE、IRAK1和β-tubulin抗體均按1∶1 000稀釋，抗TRAF6抗體按1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜。根據I抗種屬加入II抗（1∶5 000），室溫搖床上孵育1 h，經TBST充分洗掉未結合的II抗，使用ECL發光液顯影。ImageJ軟件分析蛋白條帶的灰度值，以β-tubulin為內參照。

2.5 免疫組化染色 石蠟切片常規脫蠟至水，用檸檬酸鹽進行抗原修復，使用3%H2O2抑制內源性過氧化物酶，5%山羊血清室溫封閉，加入抗4-HNE抗體（1∶200），4℃濕盒孵育過夜。加II抗室溫孵育，使用DAB法顯色，蘇木素復染細胞核，中性樹膠封片后光鏡下觀察腎組織中4-HNE的表達情況。使用PBS替代I抗作為陰性對照組。

3 統計學處理

采用GraphPad 5.0統計軟件進行分析，計量資料用均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間比較采用獨立樣本的t檢驗分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 小鼠腎臟基本指標的檢測結果

造模結束后稱量小鼠體重，發現T4組小鼠體重較同期對照組明顯減輕（P＜0.01）；此外，T4組小鼠腎臟體積變大，重量增加，腎臟重量/體重比（HW/BW）和腎臟重量/脛骨長度比（HW/TL）明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），說明小鼠腹腔注射過量的T4可引起腎臟肥大，見圖1。

Figure 1.The changes of kidney indicators in the mice.A：body weight（BW）；B：kidney size；C：kidney weight（KW）；D：KW/BW；E：KW/tibial length（TL）.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖1 小鼠腎臟基本指標的檢測結果

2 甲亢小鼠腎臟的病理變化

腎臟組織經HE染色后發現，對照組小鼠腎臟組織結構未見明顯異常；T4組可見腎小管管腔變大，腎小管上皮細胞腫脹、脫落及空泡樣變性，腎小球萎縮等病理改變，見圖2。

3 甲亢對小鼠腎臟氧化應激相關指標的影響

與對照組相比，T4組小鼠腎臟中關鍵的抗氧化酶SOD的活性顯著下降（P＜0.01），脂質過氧化醛基產物MDA的含量顯著增多（P＜0.05），見圖3A、B。Western blot結果顯示，T4組小鼠腎組織中4-HNE修飾蛋白顯著增多（P＜0.05），見圖3C。進一步用免疫組化方法檢測腎組織中4-HNE修飾蛋白的變化，同樣發現T4組4-HNE修飾蛋白顯著增多（P＜0.05），且在腎小管中增多較明顯，提示腎組織中腎小管損傷較嚴重，見圖3D。

Figure 2.The pathological changes of mouse kidney tissues in control group and T4 group（HE staining，×200）.Black arrows indicate renal tubular injury.圖2 小鼠腎臟組織病理的改變

Figure 3.The changes of oxidative stress indicators in the kidney tissues of mice.A and B：the levels of superoxide dismutase（SOD）and malondialdehyde（MDA）in the kidneys；C：Western blot results of 4-HNE-modified proteins in the kidney tissues（βtubulin was used as a loading control）；D：accumulation of 4-HNE-modified proteins measured by immunohistochemical method（×400）.Neg：negative control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 小鼠腎臟組織中氧化應激相關指標的變化

4 甲亢小鼠腎臟中IRAK1和TRAF6蛋白的表達

Western blot結果顯示，與對照組相比，T4處理后小鼠腎組織中IRAK1和TRAF6蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖4。

討 論

甲亢是以代謝活躍和興奮異常增高為主要表現的與內分泌相關的常見臨床疾病，其發病機制主要與機體內過量的甲狀腺激素水平有關。甲亢會對身體造成極大的危害，如果長期不進行干預治療，則會導致神經、循環和消化系統等全身多系統多器官發生疾病［2，8］。甲亢對腎臟的損傷已引起人們的重視，過量的甲狀腺激素可能直接作用于腎臟或通過全身血液動力學、代謝和心血管作用間接影響腎臟，引起腎小球濾過率和腎小管重吸收率的增加，同時可伴有腎血管擴張等病理表現［3］。之前有文獻報道炎癥在腎損傷中發揮重要作用［9］，但甲亢對腎臟造成的損傷是否也通過炎癥機制進行調節尚無報道。因此探究甲亢造成腎損傷的發病機制，尋找甲亢靶作用于腎臟的藥物以降低其發病率尤為重要。本實驗采用腹腔注射外源性T4的方法建立甲亢小鼠模型，結果顯示給予T4稀釋液組的小鼠體重與同期對照組相比明顯減輕，腎臟體積變大，重量增加，腎臟重量與小鼠脛骨長度比值增加，說明體內過高的甲狀腺激素水平可以誘導小鼠腎臟發生肥大。此外腎臟HE染色結果發現，與對照組相比，T4組小鼠腎小管管腔變大，腎小管上皮細胞出現腫脹、脫落及空泡樣變性等改變。這些結果表明腎臟是甲亢的重要受累器官，甲亢可引起明顯的腎臟損傷。

Figure 4.The protein expression of IRAK1 and TRAF6 in the kidney tissues of the mice detected by Western blot.β-tubulin was used as a loading control.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group.圖4 小鼠腎臟組織中IRAK1和TRAF6蛋白表達的變化

氧化應激發生時，體內活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）產生過多，氧化程度超過了抗氧化系統的清除能力，則會導致脂質過氧化反應。此反應過程中產生的脂質過氧化產物，會催化裂解產生醛基產物MDA，其毒性作用給細胞造成不可逆的損傷，通過凋亡或壞死的方式誘導細胞死亡［10-11］；而SOD為機體主要的自由基抗氧化清除酶之一，其活性程度可反應機體的抗氧化應激水平。在本研究中，血液中過量的甲狀腺激素可導致腎組織中SOD活性下降，MDA醛基產物和4-HNE修飾蛋白增多，說明過量的甲狀腺激素增加了小鼠體內的氧化損傷程度。導致這一結果的原因，可能與甲狀腺激素本身的代謝調節作用有關［12］。過量的甲狀腺激素通過誘導特定的線粒體酶加速基礎代謝率和氧化代謝，這些酶可以直接與ROS結合［13-14］，產生包括4-HNE在內的有毒醛類物質。因此我們推測小鼠體內4-HNE修飾蛋白的增多，增加了細胞毒性，破壞了腎臟的結構和功能，導致腎臟細胞受損。降低氧化損傷水平，可能會在一定程度上緩解甲亢引起的腎損傷。

之前有研究報道，4-HNE可誘導炎癥反應［15-16］，且炎癥作為腎損傷機制的相關研究也引起研究者的興趣。IRAK1是調節免疫反應的相關因子，也是可參與到Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號傳導通路等炎癥反應過程中的重要促炎因子［17］。TRAF6是TLR家族成員之一，是炎癥調控相關因子，通過介導炎癥和凋亡信號通路參與炎癥反應和免疫應答［18］。本研究結果顯示，T4組小鼠腎臟中IRAK1和TRAF6蛋白表達水平明顯高于對照組，這說明甲亢小鼠腎組織炎癥反應增強，IRAK1和TRAF6在共同調控甲亢性腎損傷中發揮著重要作用。不少研究報道，當TLR4受體相關因子作用被激活時，IRAK1可與TRAF6結合使其活化，進一步激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB），從而形成 IRAK1/TRAF6/NF-κB通路發揮炎癥調節作用［19-21］。此外，NF-κB的激活可調節下游TNF-α、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-10等各種炎癥細胞因子，從而實現IRAK1和TRAF6對炎癥通路的調控［7］。

綜上所述，本研究發現了過量甲狀腺激素導致4-HNE修飾蛋白增多，4-HNE通過IRAK1和TRAF6介導的炎癥反應機制激活炎癥相關通路，從而實現對小鼠腎損傷的正向調控作用。因此，本研究證明了過量的甲狀腺激素造成小鼠腎臟損傷的機制可能與氧化應激水平升高和炎癥反應增強有關，但具體調控機制仍需進一步研究。