涎腺腺樣囊性癌組織SEMA3G表達及甲基化研究

侯秀秀 朱欣 凌志強 朱栩杭 許敏達 趙智翔 葛明華

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma,SACC）是較常見的涎腺惡性上皮源性腫瘤，可發生于任何大小的涎腺，由于發病隱匿，且具有局部浸潤性和沿神經血管擴散的特性，邊界難以控制，術后易復發、轉移，多數患者預后不良[1-2]。研究表明，SACC發生、發展與多種分子機制有關，其中DNA甲基化在SACC致癌及進展過程中發揮關鍵作用[3]，如AQP1基因[4]、E-CAD基因[5]、SBSN 基因[6]、RASSF1A 基因[7]、RUNX3 基因[8-10]。近年來，相關基因DNA甲基化與SACC發生、發展的相關性也成為研究熱點。信號素分子3G（Semaphorin 3G，SEMA3G）是一種重要的分泌型糖蛋白，屬于信號素家族成員，可通過神經菌毛素 2（neuropilin-2，NRP-2）受體、神經叢蛋白（Plexin）與血管內皮細胞生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）結合參與血管生成[11-12]。研究發現SEMA3G在多種惡性腫瘤中呈現不同程度的缺失和表達下調，并且通過多種信號通路發揮抑制腫瘤細胞生長、增殖及侵襲轉移的作用[13]。然而，SEMA3G與SACC的相關研究不多。本研究通過免疫組化法檢測SEMA3G在SACC組織中的表達水平，采用實時熒光定量甲基化特異性聚合酶鏈反應（quantitative methylation-specific PCR,qMSP）檢測SEMA3G基因啟動子區甲基化水平，探討其與SACC患者臨床病理特征及預后的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2002年2月至2013年12月在中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）接受手術、術前未行放化療、病例資料保存完整的SACC患者55例，其中男22例，女33例；年齡24～78歲，中位年齡52歲。收集其SACC組織標本，并取相對應的癌旁正常組織作為對照。由3名病理科醫師對SACC作診斷分類，其中篩狀型30例，腺管型11例，實體型14例；肌層浸潤22例，無肌層浸潤33例；累及神經24例，未累及神經31例；遠處轉移5例，無遠處轉移50例；根據國際抗癌聯合會（UICC）2002年第6版TNM分期：Ⅰ～Ⅲ期24例，Ⅳ期31例。本研究經中國科學院大學附屬腫瘤醫院（浙江省腫瘤醫院）倫理委員會批準，患者及家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 收集患者的一般資料及臨床病理特征，包括性別、年齡、腫瘤部位、TNM分期、組織類型、是否侵犯鄰近組織、是否累及神經、是否肌層浸潤、是否復發等。手術標本均經甲醛固定，石蠟包埋，連續切片行病理學檢查。采用電話回訪，統計生存和死亡情況，如電話隨訪3次無回音，或地址所在派出所查詢無此人信息，則定為失訪。

1.2.2 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達水平檢測 采用免疫組化SP法。所有組織切片（4 μm厚）用二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，采用EDTA緩沖液高溫微波抗原修復，5%過氧化氫溶液清除內源性過氧化物酶，SEMA3G一抗（英國Abcam公司）4℃冰箱靜置孵育過夜，二抗室溫孵育30 min，DAB顯色、蘇木素染核、促藍液染質、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，由3名病理科醫師獨立閱片打分，取平均值為最終值。評分標準采用半定量法：高倍鏡下評估細胞染色強度：未著色為陰性（0分）、淡黃色為弱陽性（1分）、黃色為陽性（2分）、棕褐色為強陽性（3分）；低倍鏡下評估細胞陽性染色百分比：0%～1%為 0分，1%～10%為 1分，10%～50%為2分，50%～80%為3分，＞80%為4分。最終免疫組化染色得分=染色強度×陽性染色百分比。陰性0～4分，陽性 5～12 分。

1.2.3 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G基因啟動子甲基化水平檢測 采用qMSP法。所有組織標本取3～5張7 μm厚的連續石蠟切片，行HE染色，37℃烘箱中干燥過夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，將上述切片置于光學顯微鏡下，用27G注射針頭小心挑取SACC細胞和癌旁正常細胞（約3 000～5 000個），嚴格按照QIAampDNA抽提試劑盒（德國Qiagen公司）中提供的操作說明提取和純化微量DNA。采用EpiTectDNA亞硫酸氫鹽修飾試劑盒（德國Qiagen公司），按照說明書中的操作步驟對DNA進行亞硫酸氫鈉修飾及純化。根據SEMA3G基因序列設計CpG島特異性的甲基化和非甲基化引物，采用ABI 7500 PCR儀對亞硫酸氫鈉法修飾的DNA進行qMSP分析。SEMA3G相關引物序列（生工生物有限公司）如下：SEMA3G（M）-F：5′-AATTATAATCGGCGGTTAGCGG-3′，SEMA3G（M）-R：5′-CCGCAAACGAAACACACTAAAAC-3′；SEMA3G（U）-F：5′-AATTATAATTGGTGGTTAGTGGGA TTAG-3′，SEMA3G（U）-R：5′-ACCACAAACAAAACACACTAA AACCA-3′。使用SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（日本TaKaRa公司）按操作步驟進行PCR反應。55例樣本組織分別進行甲基化PCR擴增和非甲基化PCR擴增，根據所得的Ct值和標準曲線計算樣本中DNA甲基化的相對百分比率，甲基化率計算公式：甲基化率（M%）=[甲基化DNA拷貝數（/甲基化DNA拷貝數+非甲基化DNA拷貝數）]×100%。M%＜20%：0分；20%～40%：1分；40%～60%：2分；60%～80%：3分；＞80%：4分。本研究將0分定義為無甲基化，其余歸類于有甲基化，其中1～3分為部分甲基化，4分為完全甲基化。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0統計軟件。計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達水平比較 SEMA3G主要在細胞核中陽性表達，見圖1（插頁）。SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G表達陽性率分別為43.64%（24/55）、96.36%（53/55），SEMA3G 在SACC組織中表達較在癌旁正常組織中明顯下調，差異有統計學意義(P＜0.05）。

圖1 涎腺腺樣囊性癌（SACC）組織與癌旁正常組織中信號素分子3G（SEMA3G）的表達（a、b：篩狀型SACC組織陰性、陽性表達；c、d：腺管型SACC組織陰性、陽性表達；e、f：實體型SACC組織陰性、陽性表達；g、h：癌旁正常組織陰性、陽性表達；免疫組化染色，×400）

2.2 SACC組織與癌旁正常組織SEMA3G基因甲基化水平比較 SACC組織SEMA3G基因甲基化率為87.27%（48/55），其中完全甲基化率 49.10%（27/55），部分甲基化率38.18%（21/55）；癌旁正常組織SEMA3G基因甲基化率為9.09%（5/55），均為部分甲基化。SACC組織SEMA3G基因甲基化水平高于癌旁正常組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 SACC患者SACC組織SEMA3G表達水平、基因甲基化水平與臨床病理特征的關系 T1～3級SACC患者SEMA3G表達水平高于T4級患者，而SEMA3G甲基化水平低于T4級患者（均P＜0.05）。TNM分期Ⅰ～Ⅲ期患者SEMA3G表達陽性水平高于Ⅳ期患者，而SEMA3G甲基化水平低于Ⅳ期患者（均P＜0.05）。無肌層浸潤的SACC患者SEMA3G表達水平高于有肌層浸潤患者（P＜0.05）。未復發的SACC患者SEMA3G表達水平高于復發SACC患者（P＜0.05）。SEMA3G基因甲基化水平與SACC患者T分級、TNM分期有關（均P＜0.05）。而不同性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、是否侵犯鄰近組織、淋巴結轉移、神經累及、遠處轉移的SACC患者SACC組織SEMA3G表達水平及基因甲基化水平比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。

2.4 SACC患者SACC組織SEMA3G表達水平與預后的關系 55例患者2例失訪，隨訪5～145個月，中位隨訪時間56個月。SEMA3G表達陽性的24例患者中死亡4例，SEMA3G表達陰性的31例患者中死亡12例。不同SEMA3G表達水平的患者無進展生存期比較差異有統計學意義（P＜0.05），生存曲線見圖2。

3 討論

圖2 信號素分子3G（SEMA3G）陽性表達與陰性表達患者生存曲線比較

SACC是口腔頜面部較常見的惡性腫瘤，具有血管浸潤性及神經侵襲性，常導致腫瘤浸潤范圍較廣，手術不能完全切除，預后較差，即使術后合并放化療等綜合治療效果仍不令人滿意[1]。近些年臨床研究者致力于篩選與SACC發生、發展相關的生物標志物，希望為更好地篩選、診斷及治療SACC提供思路。信號素家族成員是一類高度保守的分泌型或跨膜型糖蛋白，其與腫瘤的發生、發展密切相關。SEMA3G通過與NRP-2受體和Plexin受體結合形成復合體，介導下游的信號轉導，對腫瘤細胞生長、血管形成有不同程度的抑制作用[13]。相關研究顯示SEMA3G能夠明顯抑制胰腺癌的增殖、侵襲和轉移；將穩定表達SEMA3G的乳腺癌細胞株MDA-MB-435接種到裸鼠體內發現腫瘤生長體積及重量受到了明顯抑制；將其轉染至MDA-MB-231細胞系中腫瘤抑制依然存在，同時發現SEMA3G對該腫瘤的血管形成也具有明顯的抑制作用[11-15]。SEMA3G高表達可以抑制黑色素瘤的生長及血管形成[13]；SEMA3G的表達下調可導致VEGF相關的惡性間皮瘤中血管生成和腫瘤生長抑制活動的喪失[11]。同時SEMA3G也可抑制U251膠質瘤細胞的增殖，可通過抑制基質金屬蛋白酶（MMP）-2的表達，從而減弱神經膠質瘤細胞侵襲和遷移能力，發揮抑癌基因的作用[15]，人腦膠質瘤中SEMA3G的表達水平同患者預后生存期存在相關性，SEMA3G可以作為腦膠質瘤的一個預后評估指標[12,15]。本研究結果顯示43.64% SACC組織中SEMA3G表達陽性，遠遠低于SEMA3G在癌旁正常對照組織中的表達陽性率，其中T4級及TNM分期Ⅳ期SACC組織中SEMA3G表達水平明顯低于T1～3分級及Ⅰ～Ⅲ分期SACC組織；有肌層浸潤及復發的SACC組織中SEMA3G表達水平明顯低于無肌層浸潤及無復發的組織；而SEMA3G表達水平與SACC患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、有無侵犯鄰近組織、淋巴結轉移、神經累及、肌層浸潤及遠處轉移無明顯關系。Kaplan-Meier分析顯示，SEMA3G表達陰性患者預后較差。上述結果提示SEMA3G表達陰性可能是SACC疾病進展過程中的危險因素，SEMA3G基因在SACC發生、發展中發揮抑癌基因的作用。

表1 SACC患者SACC組織SEMA3G表達水平、基因甲基化水平與臨床病理特征的關系[例（%）]

表觀遺傳學中DNA甲基化與人類常見的惡性腫瘤發生、發展關系密切，抑癌基因啟動子區異常高甲基化可導致其轉錄失活，從而促進腫瘤的發生、發展[3]。本研究采用了qMSP法檢測了55例SACC組織和配對癌旁正常組織中SEMA3G基因啟動子區甲基化情況，結果顯示87.27%的SACC組織中存在SEMA3G基因啟動子5′-CpG島甲基化，其中完全甲基化水平達49.10%；而癌旁正常組織甲基化水平僅為9.09%，提示DNA甲基化可能是SEMA3G在SACC組織中低表達的原因之一。與臨床病理特征的關系分析表明，T4分級及TNMⅣ期SACC組織中SEMA3G甲基化水平達100%，相比于T1-3分級及TNM分期Ⅰ～Ⅲ期組織，差異有統計學意義，而SEMA3G基因甲基化水平與SACC患者的性別、年齡、腫瘤位置、組織類型、有無侵犯鄰近組織、淋巴結轉移、神經累及、肌層浸潤、遠處轉移及復發無明顯關系。本研究初步評估了SEMA3G基因在SACC組織中的甲基化水平，后續筆者將在SACC細胞中檢測SEMA3G的甲基化水平及5-氮雜-2′-脫氧胞苷處理后的去甲基化狀態下SEMA3G的表達水平，并完善相關細胞功能實驗。

綜上所述，SEMA3G基因啟動子區高甲基化可能是其在SACC組織中表達下調的原因之一，并參與了SACC的發生與預后，但SEMA3G在SACC中的具體分子機制尚需進一步深入研究，SEMA3G在SACC診斷和預后評估中的價值仍需更多大樣本臨床實驗驗證。