時差成像系統在選擇高發育潛能未成熟卵母細胞體外成熟受精胚胎中的應用

狄春光 王麗萍 王慧 王功發 王毅 朱琴

時差成像系統（time-lapse imaging system，TLI）為非侵入胚胎評估系統，通過對常規體外受精（in vitro fertilization，IVF）周期中培養過程中的胚胎連續觀察，獲得胚胎發育的時間參數，從而準確評估其發育潛能[1]。TLI克服了傳統評估方法對胚胎發育觀察不夠全面、缺少可量化指標等缺點。胚胎暴露于大量光源中不利于胚胎的發育，而TLI對胚胎的總光源暴露量明顯低于IVF實驗室傳統倒置顯微鏡觀察所需[2]。研究表明采用TLI觀察胚胎不會對胚胎發育產生不利影響，是安全的[3-5]。已有研究者利用TLI與傳統的形態學評估方法結合，建立了一系列較為科學的胚胎評估體系用于挑選最具妊娠潛能的胚胎，以改善臨床妊娠結局[6-7]。未成熟卵母細胞體外成熟（in vitro maturation，IVM）是一項新的輔助生殖技術，用于治療難治性多囊卵巢綜合征不孕和誘導排卵周期中卵巢反應不良的患者。因IVM技術在體外進行，卵母細胞生長的微環境發生改變會導致其成熟機制也發生改變，進而會影響后續胚胎的發育潛能，有研究表明未成熟卵母細胞IVM后形成胚胎（IVM胚胎）發育潛能較正常胚胎發育潛能差[8]。目前，IVM胚胎的臨床妊娠率為35%～40%，低于正常胚胎妊娠率[9]。因此，如何提高IVM胚胎的臨床妊娠率是一個迫切需要解決的問題。目前國內外利用TLI評估正常IVF周期胚胎發育潛能提高臨床妊娠率的研究不少，但利用TLI選擇高發育潛能的IVM胚胎的報道不多。本研究旨在探討如何利用TLI選擇高發育潛能的IVM胚胎，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2016年2月至2019年5月在嘉興市婦幼保健院生殖中心接受體外受精-胚胎移植治療患者的525枚未成熟卵母細胞進行IVM；同時收集周期中正常成熟卵母細胞207枚，進行體外培養。IVM成熟卵細胞及正常成熟卵細胞均行卵細胞漿內單精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），受精所用精子均來自患者丈夫，受精后的胚胎在TLI系統中觀測培養。排除艾滋、梅毒、乙型病毒性肝炎抗原陽性患者。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有納入對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 IVM培養液準備 G-2 plus胚胎培養液（瑞典Vitrolife公司），75 U/L促卵泡生成素和150 U/L人絨毛膜促性腺激素（瑞士 Serono公司），0.2 μg/ml 17β-雌二醇（美國Sigma公司）。

1.2.2 未成熟卵母細胞收集和培養 患者按本中心常規方案進行促排卵，在陰道超聲引導下取卵。ICSI前拆除卵母細胞周圍的大部分顆粒細胞，經倒置顯微鏡觀察卵母細胞的成熟程度，未成熟卵母細胞（GV期或MI期）為本研究觀察對象。將未成熟卵母細胞移入IVM培養皿中培養24～40 h，如果卵細胞成熟則行ICSI，受精卵在TLI觀測下培養。

1.2.3 TLI使用和胚胎培養 研究使用Primo Vision（瑞典 Vitrolife公司）的TLI，圖像采集1次/5 min，共連續培養6 d。所有胚胎均采用9孔培養皿（瑞典Vitrolife公司），卵裂期胚胎培養液為37℃6% CO2平衡過夜的G-1 plus胚胎培養液（瑞典Vitrolife公司）。囊胚培養為37℃ 6% CO2平衡過夜的G-2 plus胚胎培養液（瑞典Vitrolife公司）培養液，培養過程中均有Primo Vision成像系統采集圖像，并作胚胎發育的時間參數與卵裂模式分析。

1.2.4 胚胎發育時間參數和卵裂模式設定 將ICSI受精時間記為“0”點，原核消失時間標記為PND（pronuclear disappearance），發育至2細胞時間為 t2，發育至3細胞時間為t3，以此類推為 t4、t5。2細胞發育至 3細胞所需時間為cc2，3細胞發育至4細胞所需時間為 s2。各時間點的命名方法參照Ciray標準。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂及異常卵裂,其中異常卵裂模式包括不均、非軸性卵裂、大碎片、非二倍性卵裂、發育阻滯、非對稱卵裂、卵裂球碎裂及卵裂球融合。

1.2.5 胚胎評估標準 卵裂期胚胎評估參考 Peter標準，囊胚期胚胎評估參考Gardner標準。優質胚胎：細胞數7～12個，碎片≤20%；D3可利用胚胎：細胞數≥4個，碎片≤30%。

1.3 統計學處理 采用SPSS 25.0統計軟件。計數資料以頻數和構成比表示，組間比較采用χ2檢驗。用四分位數法對時間參數進行分類分析，以囊胚形成率為結局，計算各參數的優勢時間段。采用logistic回歸分析時間參數與囊胚形成率的關系。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IVM胚胎與正常胚胎培養結果比較 402枚未成熟卵母細胞進行IVM，共有315枚成熟，成熟率為78.4%；該315枚成熟卵細胞進行ICSI后進一步行TLI動態觀察及囊胚培養。IVM胚胎D3可利用胚胎率、D3優胚率、囊胚形成率均低于正常胚胎（均 P＜0.05），非二倍性卵裂率大于正常胚胎（P＜0.05），見表1。

表1 IVM胚胎與正常胚胎培養結果比較[例（%）]

2.2 時間參數與胚胎發育潛能的關系 用四分位數法對 IVM 胚胎各時間參數（PND、t2、t3、t4、t5、cc2 和 s2）進行分段統計,根據時間參數各段的囊胚形成率，將連續2段擁有囊胚形成率的時間定義為該時間參數的優勢時間段。優勢時間段：PND 為（18.08～25.25）h，t2 為（20.74～27.89）h；t3 為＜29.75 h，（29.75～36.36）h；t4為＜31.97 h，（31.97～37.53）h，t5 為 （37.50～52.68）h，cc2 為（5.05～12.02）h，s2 為≥1.03 h，見表 2。通過 logistic回歸分析，顯示 t5（OR=1.029，95% CI：1.011～1.048）與形成囊胚最具相關性，見表3。

2.3 t5優勢時間段內胚胎的囊胚形成能力驗證結果 用后期收集的123枚未成熟卵母細胞形成的IVM胚胎時間參數與囊胚形成率的關系驗證t5的預測價值。123枚未成熟卵細胞經IVM成熟92枚，受精后得到D3可移植胚胎43枚，經囊胚培養形成13枚囊胚，其中在t5優勢時間段內D3可移植胚胎15枚形成囊胚9枚，囊胚形成率為60.0%,顯著高于非t5優勢時間段內囊胚形成率為14.3%（P＜0.05），證實t5優勢時間段具有預測性。

3 討論

人類輔助生殖技術的成功目標是獲得健康的胎兒，對于難治性多囊卵巢綜合征不孕和誘導排卵周期中卵巢的反應不良的患者，IVM技術是治療此類患者最為有效的措施。但IVM后卵母細胞形成胚胎發育能力較差的問題始終困擾著大家，胚胎發育是一個連續的動態過程，胚胎發育過程中任何非時間順序相關的不正常事件都會導致胚胎發育異常，如胚胎直接從1細胞卵裂為3細胞、卵裂球多核化、胚胎空泡化、碎片化等。TLI技術對胚胎不間斷地連續觀察，可連續獲取胚胎發育全過程的動態影像，可對胚胎發育進行更加全面和細致的記錄。以上所提到的異常事件及與胚胎發育潛能密切相關的生物學特征，如原核的形成及消失、卵裂時間等都可以幫助胚胎學家對胚胎發育有更深的理解，通過對胚胎發育相關時間參數的分析，可以更好的預測發育潛能高的胚胎。本研究中通過TLI對胚胎發育進行動態觀察，將胚胎的卵裂模式及時間參數相結合，篩選發育潛能更高的胚胎進行移植，提高IVM后胚胎移植的臨床妊娠率。

正常體外受精周期中，胚胎發育中異常卵裂事件中非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率和種植率都非常低，Athayde等[10]報道其囊胚形成率為11.7%，種植率更低只有3.7%，非二倍性卵裂胚胎發育潛能差可能與其具有較高的染色體異常發生率有關[11]。IVM卵細胞的成熟包括細胞核成熟和細胞質成熟，它受多種因素影響，如培養時間、激素、顆粒細胞等，有研究發現適當延長IVM時間可促進卵母細胞的成熟過程，提高卵母細胞的核成熟率，促性腺激素可促進未成熟卵母細胞核和細胞質的成熟，利于胚胎的后期發育[12]。未成熟卵母細胞在不成熟的IVM培養條件下，受各種因素影響，其細胞核和細胞質的成熟肯定不如體內成熟的卵細胞同步，因此其細胞核發育異常的可能性高于體內成熟的卵細胞。本研究結果發現在IVM胚胎非二倍性卵裂胚胎發生率為正常胚胎的2倍多，筆者認為這可能與IVM卵細胞核成熟異常有關，另外胚胎發育停滯的發生率也高于正常胚胎，這可能同樣與IVM卵細胞核成熟異常有關。Qi等[13]報道胚胎發育停滯往往伴有染色體異常，這從側面證實了筆者的推測。

表2 四分位數法分析囊胚形成情況

表3 logistic回歸分析時間參數與胚胎發育潛能的關系

人類的合子基因組激活發生4～8細胞階段，基因組的激活對桑椹胚、囊胚至關重要，因此筆者推測4～8細胞階段的時間參數對預測胚胎發育潛能至關重要。在本研究中通過對IVM后卵母細胞胚胎時間參數與是否形成囊胚作單因素和多因素logistic回歸分析，發現t5與胚胎發育潛能最具相關性。另有研究同樣表明t5可以作為胚胎發育潛能的預測性參數[4，14]。Meseguer等[15]對285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時間、卵裂球大小和多核等作了詳細的回顧性分析，總共移植了522枚胚胎，結果顯示 t5（ICSI后 48.8～56.6 h）、s2（≤0.76 h）、cc2（≤11.9 h）這三個時間參數可以作為囊胚形成潛能的預測性參數。因此如果篩選t5優勢時間段內的胚胎在發育第3天進行移植，能加大獲得妊娠的可能性。但由于各中心的促排卵方案、培養環境及人員操作等差異可能造成各中心提取的共性參數有所不同。因此，各生殖中心應該根據自己最適合的共性參數挑選優質胚胎進行移植。