減數分裂恢復前期小鼠卵巢組織中M-CSF和NPPC的表達曲線

劉暢 張治芬

近年研究認為，排卵前促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）峰可明顯降低卵泡內C型尿鈉肽前體（natriuretic peptide precursor type C，NPPC）及環磷酸鳥苷（cyclic guanosine monophosphate，cGMP）表達水平，使得卵母細胞減數分裂恢復，但LH受體僅位于壁層顆粒細胞表面，卵丘顆粒細胞及卵母細胞表面均無LH受體[1]，故LH如何將排卵及減數分裂恢復的信號傳至卵母細胞尚無定論。

巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）是由單核吞噬細胞產生的一種特異性生長因子，屬于造血因子的范疇。1992年Arceci等[2]研究發現妊娠期輸卵管及子宮均表達M-CSF，在卵母細胞、著床前胚胎和胎盤中亦可檢測到M-CSF受體（macrophage colony-stimulating factor receptor，M-CS－FR）的表達，由此推測M-CSF參與調節卵母細胞的成熟。隨后有研究發現M-CSF基因缺失小鼠發情周期延長，成熟卵泡減少，排卵率降低，而給予補充M-CSF后可逆轉上述改變[3]，證實了M-CSF在卵泡發育成熟及排卵中的重要作用。那么，LH導致卵母細胞減數分裂恢復及排卵是否與M-CSF及其受體的信號傳導相關，值得進一步深入研究。以往研究中并未在LH/人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotophin，hCG）峰后觀察M-CSF、M-CSFR、NPPC基因及其編碼的C型尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）表達的時間變化曲線。故本研究擬通過動物實驗探索hCG促排卵后4 h內卵巢組織中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白及mRNA表達的變化曲線，探索M-CSF及其受體對NPPC表達的影響，推測其在減數分裂恢復中的作用機制，為女性排卵障礙的診治提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 免疫組化法中兔抗小鼠M-CSF一抗、兔抗小鼠M-CSFR一抗購于英國Abcam公司；二抗（山羊抗兔抗體）和DAB顯色劑購于丹麥DAKO公司；熒光定量PCR法中RNeasy miRNA提取試劑盒和引物購于美國Invitrogen生物科技有限公司，其他實驗化學試劑購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 主要儀器 RM2016型病理切片機購于上海徠卡儀器有限公司；Nikon Eclipse Ti-SR倒置熒光顯微鏡為日本尼康公司產品；JB-P5型包埋機購于武漢俊杰電子有限公司；Step one plus型ABI 7500熒光定量PCR儀為美國Applied Biosystems公司產品。

1.3 實驗動物 SFP級雌性青春期前（25 d齡）C57BL/6小鼠共15只，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK（滬）2013-0016]，飼養于浙江省醫學科學院動物中心 [實驗動物許可證號碼：SYXK（浙）2014-0008]。

1.4 小鼠模型的建立 小鼠腹腔注射5 U孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin，PMSG）進行預處理，促進卵泡發育；48 h后腹腔注射5 U hCG誘發排卵，注射后 0、0.5、1、2、4 h分別處死小鼠 3只并做好標記，以眼科剪快速取出卵巢組織，避免用手或鑷子擠壓。一側卵巢組織立即投入10%甲醛固定液中浸沒并編號，待HE染色和免疫組化法分析其M-CSF、MCSFR、CNP蛋白表達情況；另一側卵巢組織分離后立即-80℃冰凍保存，以備熒光定量PCR檢測。動物飼養和實驗操作過程符合《實驗動物飼養管理和使用指南》的規定。

1.5 HE染色觀察卵巢組織中各級卵泡的發育情況卵巢組織固定24 h后常規HE染色（切片厚度5 μm），光鏡下觀察卵巢組織內各級卵泡結構特征。

1.6 免疫組化法檢測卵巢組織中NPPC、M-CSF及MCSFR的蛋白表達 將卵巢組織石蠟切片脫蠟水化，抗原修復后磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌，3%過氧化氫（H2O2）室溫避光孵育20 min阻斷內源性過氧化物酶，再以pH=7.4的PBS洗滌。以含5% FBS白蛋白稀釋一抗，稀釋比例1：200，于4℃孵育過夜。玻片洗滌后滴加二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色，Harris蘇木素復染，脫水后中性樹膠封片。選取包含排卵前卵泡的卵巢組織切片為計算對象，隨機挑選3個200倍視野拍照。應用Image Pro Plus 6.0（Media Cybernetics，Inc.USA）軟件，選取相同的棕黃色作為陽性判斷的統一標準，分析出陽性區域累積光密度值（integrate optical density，IOD），根據圖片中卵巢組織所占面積（AREA），通過公式IOD/AREA，計算平均光密度值。

1.7 熒光定量PCR檢測卵巢組織中NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表達 取出凍存標本，嚴格按照說明書操作流程，使用RNeasy miRNA提取試劑盒分離提取RNA，通過熒光定量PCR儀分別測定NPPC、M-CSF及M-CSFR的mRNA表達水平，內參基因選擇Rpl19。引物合成于武漢谷歌生物科技有限公司，引物序列見表1。所有檢測至少重復3次。

表1 引物序列

1.8 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件。計量資料以表示，各時點間比較采用One-Way ANOVA。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 排卵前卵泡發育情況 卵巢組織切片HE染色后可見竇前卵泡（preantral follicle，PF）、竇卵泡（antral fol－licle，AF）。成熟卵泡內各部分結構清晰可見，其中卵泡最外層的線性結構為卵泡膜，緊貼卵泡膜分布的顆粒細胞為壁層顆粒細胞（mural granulosa cells，mGCs），mGCs內側緊貼卵母細胞（Oocyte，Oo）的顆粒細胞為卵丘顆粒細胞（cumulus cells，CCs），mGCs與 CCs之間的空腔為卵泡腔（follicullar antrum，FA），內充滿卵泡液，位于CCs中央的是Oo。CCs與Oo形成的復合體稱卵丘-卵母細胞復合體（cumulus-oocyte complex，COC），見圖1（插頁）。卵巢組織中卵泡發育不同階段，各階段卵泡及卵泡內結構均可見，說明促排卵小鼠模型建立成功。

圖1 小鼠卵巢組織中各級卵泡結構（HE染色，×100）

2.2 卵巢組織中M-CSF、M-CSFR及NPPC蛋白的表達定位 免疫組化檢測發現M-CSF及M-CSFR在卵泡中mGCs、CCs均有表達；CNP主要由mGCs表達，尤其是與CCs相連部分的mGCs中表達較明顯，CCs也有少量表達，見圖2-4（插頁）。

圖2 M-CSF在卵巢組織中的表達（HE染色，×100）

圖3 M-CSFR在卵巢組織中的表達（HE 染色，×100）

圖4 CNP在卵巢組織中的表達（HE 染色，×200）

2.3 卵巢組織中各時點M-CSF、M-CSFR及CNP蛋白表達水平的變化 促排卵后小鼠卵巢組織中M-CSF蛋白表達水平于2、4 h明顯下降，與其他時間點比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05），M-CSFR蛋白表達水平隨著時間的延長逐漸降低，各時點平均光密度值之間的差異均有統計學意義（均P＜0.05）。此外，CNP表達水平在1、2 h顯著增高，與其他時點比較，差異均有統計學意義（均 P＜0.05），而 0、0.5、4 h之間的差異無統計學意義（P＞0.05），見圖 5。

2.4 卵巢組織中各時點 M-CSF、M-CSFR及 NPPC mRNA的表達水平變化 促排卵后小鼠卵巢組織中NPPC mRNA表達水平1、2 h顯著升高，與其他時點比較，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；而M-CSF、MCSFR mRNA在注射hCG后均呈持續低水平表達，各時點之間的差異均無統計學意義（均P＞0.05），見圖6。

圖5 卵巢組織中各時點巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子受體（M-CSFR）及C型尿鈉肽（CNP）蛋白表達水平的變化（注：與其他時點比較，*P＜0.05）

3 討論

集落刺激因子家族（colony-stimulating factors，CSFs）是一組18～70 kDa的不穩定糖蛋白，主要包括3種：M-CSF，亦稱CSF-1；粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GMCSF），亦稱CSF-2；粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF），亦稱 CSF-3。M-CSF可提高吞噬細胞殺傷腫瘤細胞和微生物的能力，還作用于生殖細胞，影響卵巢功能，促進胎盤滋養細胞發育、協助胚胎生長等，參與機體生殖內環境平衡的維持。有研究發現，M-CSF可促進卵泡發育及排卵，并增加顆粒細胞的增殖能力[3]。本實驗中，通過免疫組化法研究發現促排卵小鼠卵泡內M-CSF及其受體分布廣泛，mGCs及CCs均有表達，故推測其在卵泡發育成熟及減數分裂恢復的過程中很有可能起著重要的作用。

本研究從蛋白及mRNA兩方面測定卵巢組織中M-CSF表達水平，結果提示在hCG刺激后，M-CSF表達呈下降趨勢，直至較低水平。以往研究表明，正常月經周期卵泡發育過程中，血清M-CSF及其受體表達呈上升趨勢，并在排卵日達到峰值[4]，這與逐漸升高的雌激素及促性腺激素水平相關[5]，Zhang等[6]的研究也提出類似結論。在卵泡發育早中期，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）刺激顆粒細胞分泌雌二醇（estradiol，E2）和M-CSF，不斷增加的E2水平反過來刺激卵泡內顆粒細胞和巨噬細胞分泌M-CSF。而M-CSF可能與FSH存在協同作用，共同促進卵泡發育及雌激素的分泌；到了卵泡晚期，隨著體內雌激素濃度的進一步上升，抑制了M-CSF的分泌，以減弱其與FSH的協同作用，防止卵泡的過度生長，同時避免M-CSF的其他生物學效應，從而維持內環境穩態。結合本研究，推測高劑量的LH/hCG刺激后，卵泡內M-CSF及其受體水平表達持續下降至低水平，這與LH峰之前雌激素峰以及LH峰后低雌激素水平相關。

圖6 卵巢組織中各時點巨噬細胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬細胞集落刺激因子受體（M-CSFR）及C型尿鈉肽前體（NPPC）mRNA表達水平的變化（注：與其他時點比較，*P＜0.05）

本實驗中還通過免疫組化定位CNP的表達，結果顯示卵巢組織中CNP主要表達于mGCs上，同時CCs上亦有少量表達。這與以往的研究有所偏差，之前認為CNP僅表達于mGCs表面[6]，考慮由于免疫組化法結果與實驗人員主觀判斷相關性較大，進一步可以行卵泡內原位雜交PCR法以確認。

mGCs中CNP與CCs上鈉尿肽受體 2（natriuretic peptide receptor 2，NPR2）結合后，刺激CCs合成并分泌cGMP。體外培養COCs時加入NPPC，可發現CCs和Oo內的cGMP含量升高，從而阻止生發泡破裂[7]。還有一項動物研究顯示，NPPC或者NPR功能缺失或基因敲除的小鼠體內Oo往往會出現早發的減數分裂恢復[6]。以上研究結果均證實，NPPC以及其同源性受體NPR2在維持減數分裂停滯中具有重要作用。有研究運用RT-PCR分析顯示，小鼠卵泡液中NPPC mRNA及CNP蛋白表達水平均隨著卵泡的生長發育而呈上升趨勢[8]。近些年國內外研究已初步認可以NPPC/NPR2系統為核心的減數分裂調控模型，認為LH峰可抑制卵巢顆粒細胞分泌CNP，減少CNP與NPR2結合，減少cGMP的合成，從而促進減數分裂恢復[6]。且有研究指出，LH峰后2～3 h可見CNP明顯下降[9]。本研究中從mRNA與蛋白水平分別測定hCG促排卵后4 h內NPPC/CNP水平變化發現，在hCG注射后1 h，NPPC mRNA水平達高峰后隨即快速下降，2 h時CNP水平達高峰，隨后亦快速下降至較低水平，這與上述研究結果一致，提示LH/hCG可能通過某途徑下調NPPC/CNP以啟動減數分裂恢復。而hCG刺激后短時間內NPPC/CNP表達增加，考慮是其在卵泡期表達趨勢的延續，如成熟促進因子等的作用結果。筆者推測排卵前卵巢組織中NPPC基因水平的變化曲線與外周血雌激素、LH變化曲線相類似，CNP蛋白水平在LH/hCG峰后2 h出現峰值，隨后快速下降至較低水平，繼而影響卵泡內cGMP及環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，最終導致 Oo 生發泡破裂及排卵。

綜上所述，本研究結果顯示在促排卵小鼠卵巢組織中，M-CSF及M-CSFR分布廣泛，在mGCs及CCs中均有表達，而CNP主要表達于mGCs，CCs中僅少量表達。在LH/hCG促排卵后卵巢組織中M-CSF、M-CSFR水平隨即出現下降趨勢，NPPC mRNA呈上升趨勢并在1 h達高峰后顯著下降，CNP蛋白在2 h上升至峰值后隨即快速下降至較低水平，推測卵母細胞減數分裂恢復前期NPPC mRNA水平在LH/hCG峰刺激下上升至峰值后下降，其變化曲線與外周血雌激素及LH類似。