TREM-1在炎癥性腸病患者血清中的表達及其與疾病活動度的關系

王利民 沈利洪 馬閃珊 張麗英 吳俊琪

炎癥性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）是一種病因尚不明確的慢性非特異性免疫性腸道疾病，多數觀點認為是由遺傳易感個體對腸道微生物的異常黏膜免疫應答引起的疾病，包括潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）、克羅恩病（Crohn′s disease，CD）[1]，還有 10%分類不確定的IBD[2]。IBD癥狀表現多樣，腹痛、腹瀉、黏液膿血便為其主要臨床特點[3]，還有很多腸外表現：外周關節炎和杵狀指等。流行病學數據顯示，全球范圍內IBD的發病率均呈逐年上升趨勢，且發病年齡逐漸減小[4-5]。內鏡聯合病變部位病理學檢查是反應IBD疾病活動度的金標準[6]，但該方法有一定的禁忌證與局限性，且耗時長、患者痛苦大，不能反復進行監測。而血WBC、ESR、CRP等實驗室指標受各種影響因素較多，因此臨床亟需一種創傷小、可靠的生物標志物來監測IBD的活動度以指導臨床診治。髓系細胞觸發性受體1（triggering receptor on myeloid cells-1，TREM-1）是近年來發現的用于診斷早期炎癥反應的新指標，是免疫球蛋白超家族活化受體，選擇性地表達于血液中性粒細胞和單核細胞/巨噬細胞。TREM-1在感染性疾病中發揮重要作用，通過其和DNAX激活蛋白12（DNAX-activating protein of 12 kDa,DAP12）結合，活化下游信號通路，促進多種炎癥介質分泌，具有預激和誘導炎癥反應的作用。研究顯示，TREM-1不僅在感染性組織中表達上調，在非感染性炎癥、結締組織和腫瘤組織中也表達上調[7-8]。另有研究表明IBD患者腸黏膜中TREM-1表達與病情嚴重程度呈正相關[9]。那么血清中TREM-1水平是否也存在同樣關系？基于此，本研究旨在探討TREM-1在IBD患者血清中的表達水平及其與疾病活動度的關系，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年6月至2020年2月金華市中心醫院收治的IBD患者169例，其中UC患者78例，CD患者91例。另擇同期收治的普通腹瀉患者40例，健康體檢者40例。各研究對象均接受結腸鏡和組織病理學檢查。IBD患者符合中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病組《炎癥性腸病診斷與治療的共識意見》[10]中對IBD的診斷標準；依據結腸鏡、病理學檢查結果和臨床表現綜合評分分為疾病活動期（UC＞3分，CD＞5分）和緩解期（UC≤2分，CD≤4分），依賴激素維持治療符合緩解標準的也納入緩解期。普通腹瀉患者納入標準：大便次數增多，伴有大便不成形，持續時間達4周以上，經結腸鏡檢查不符合IBD的診斷。健康體檢者為同期來院體檢人員，大便次數正常，無嚴重并發癥，并排除使用非甾類抗炎藥和乙醇成癮者。IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者性別、年齡比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

表1 IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者性別、年齡比較

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 酶標分析儀RT-6100購自深圳Rayto公司；電熱恒溫水浴箱600購自上海躍進公司；洗板機BIOTEK ELX50購自美國博騰公司；全自動血沉儀IVD購自意大利SIRE ANALYTICAL SYSTEMS S.r.l公司；熒光免疫定量分析儀Getein1600購自南京基蛋生物公司；血細胞分析儀XE2100購自日本Sysmex公司。人TREM-1試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司（試劑批號：E20190308-11345B）。人鈣衛蛋白（Calprotectin，CALP）試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司（試劑批號：E20190304-10597B）。WBC配套試劑盒購自日本 Sysmex公司（試劑批號：R9531、A9010、G0009），ESR檢測無需配套試劑，CRP配套試劑盒購自南京基蛋生物公司（試劑批號：0551210518）

1.2.2 樣本采集 抽取研究對象清晨空腹外周靜脈血2管，其中1管用EDTA抗凝用于檢測WBC、ESR及CRP，另1管含有促凝劑，在室溫放置1 h，3 500 r/min離心10 min，取上清液至干燥EP管中，保存至-70℃備用，避免反復凍融。

1.2.3 參數測定 WBC水平檢測采用血細胞分析儀XE2100的流式細胞計數法，ESR水平檢測采用全自動血沉儀IVD的光學掃描法，CRP水平檢測采用熒光免疫定量分析儀的免疫熒光干式定量法。血清TREM-1和CALP水平測定：采用ELISA法；試劑盒從冷藏環境中取出后在室溫平衡，取出所需板條；設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl；樣本孔中加入待測樣本50 μl，空白孔不加；除空白孔外，標準品孔和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μl，用封板膜封住反應孔，37℃水浴60 min；棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350 μl），靜置1 min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次；每孔加入底物 A、B 各 50 μl，37 ℃避光孵育 15 min；每孔加入終止液50 μl，15 min內，在450 nm波長處測定各孔的A值；以所測標準品的A值為橫坐標，標準品的濃度值為縱坐標，繪制標準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的A值代入方程，計算出樣品的濃度。

1.3 觀察指標 （1）比較IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者血清TREM-1水平；（2）分析IBD患者血清TREM-1水平與血 CALP、WBC、ESR、CRP 水平的相關性；（3）比較 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對 UC 活動期和CD活動期的診斷效能。

1.4 統計學處理 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關。以疾病活動期為變量，采用ROC曲線分析比較TREM-1、CALP、WBC、ESR、CRP 判斷疾病活動度的診斷效能。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IBD患者、普通腹瀉患者、健康體檢者血清TREM-1水平比較 見表2。

由表2可見，UC患者血清TREM-1水平高于普通腹瀉患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。CD患者血清TREM-1水平與普通腹瀉患者比較差異無統計學意義（P＞0.05）。UC、CD患者血清TREM-1水平高于健康體檢者（均P＜0.05）。UC活動期患者血清TREM-1水平遠高于普通腹瀉患者和健康體檢者（均P＜0.05）。CD活動期患者血清TREM-1水平高于普通腹瀉患者和健康體檢者（均P＜0.05）。UC緩解期、CD緩解期患者血清TREM-1水平與普通腹瀉患者、健康體檢者比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。UC活動期患者與UC緩解期患者、CD活動期患者與CD緩解期患者血清TREM-1水平比較差異均有統計學意義(均P＜0.05)，活動期高于緩解期。

表2 UC、CD組與其他組之間的TREM-1水平比較

2.2 IBD患者血清 TREM-1水平與血CALP、WBC、ESR、CRP水平的相關性分析 見表3。

表3 血清TREM-1水平與血CALP、WBC、ESR、CRP水平的相關性分析

由表3可見，UC患者血清TREM-1水平與CALP、WBC、ESR、CRP水平均呈正相關（均 P＜0．05）。CD 患者血清TREM-1水平與CALP、WBC水平均呈正相關（均P＜0．05），與 CRP、ESR 水平無關（P ＞0.05）。

2.3 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對 UC 活動期的診斷效能比較 見圖1（插頁）、表4。

圖1 TREM-1、CALP、WBC、CRP、ESR 診斷 UC 活動期的 ROC曲線（TREM-1為髓系細胞觸發性受體1；CALP為鈣衛蛋白；UC為潰瘍性結腸炎）

表4 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR對UC活動期的診斷效能比較

由圖1、表4可見，TREM-1取83.091 pg/ml時，AUC為0.878，診斷UC活動期的靈敏度為0.738，特異度為 0.972；CALP 取 76.283 μg/ml時，AUC 為 0.903，診斷UC活動期的靈敏度為0.762，特異度為0.944；ESR取9.5 mm/h時，AUC為0.626，診斷UC活動期的靈敏度為0.810，特異度為0.444；CRP取5.05 mg/L時，AUC為0.650，診斷UC活動期的靈敏度為0.619，特異度為0.639；WBC 取 8.235×109/L 時，AUC 為 0.686，診斷 UC活動期的靈敏度為0.500，特異度為0.833。TREM-1對診斷UC活動期有較高的靈敏度和特異度。

2.4 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR 對 CD 活動期的診斷效能比較 見圖2（插頁）、表5。

圖2 TREM-1、CALP、WBC、CRP、ESR 診斷 CD 活動期的 ROC曲線（TREM-1為髓系細胞觸發性受體1；CALP為鈣衛蛋白；CD為克羅恩病）

表5 TREM-1、CALP、WBC、CRP 、ESR對CD活動期的診斷效能比較

由圖2、表5可見，TREM-1取73.470 pg/ml時，AUC為0.865，對CD活動期診斷的靈敏度為0.588，特異度為 1.000；CALP 取 42.442 μg/ml時，AUC 為 0.888，對CD活動期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.767；ESR取14.5 mm/h時，AUC為0.678，對CD活動期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.433；CRP取5.35 mg/L時，AUC為0.808，對CD活動期診斷的靈敏度為0.706，特異度為 0.600；WBC 取 5.35×109/L 時，AUC 為 0.767，對CD活動期診斷的靈敏度為0.882，特異度為0.567。TREM-1對診斷CD活動期有較高的靈敏度和特異度。

3 討論

目前臨床診斷IBD的主要方法包括結腸鏡和內鏡下活組織病理學檢查、臨床疾病活動性指數、ESR、CRP和糞便CALP。CALP是中性粒細胞和反應性的巨噬細胞胞質中重要的蛋白質，可作為急性炎性細胞活化的標志物[11]，由于糞便CALP具有抗細菌降解作用，在腸道中不容易被細菌分解，糞便CALP在常溫下能夠保持穩定長達7d，其濃度是血漿中濃度的6倍[12]。然而臨床上糞便采集保存比較困難，并且即使是同一天采集的糞便檢測結果相差比較大[13]。而血清標志物水平測定具有取樣方便、可短期內重復檢測、易于被接受等特點。

IBD是遺傳易感性個體對腸道微生物的異常黏膜免疫應答引起的伴有嚴重并發癥的持續性腸道炎癥。正常人的腸道黏膜巨噬細胞很少表達TREM-l，Schenk等[14]發現在健康人的腸黏膜單核細胞上TREM-l的表達水平顯著低于淋巴結和扁桃體，在炎癥性腸病大鼠模型中腸黏膜TREM-l表達上調。也有學者發現IBD患者中的血清TREM-l顯著高于健康人[15]。本研究表明血清TREM-1在IBD血清中特異度高，特別是在疾病活動期異常升高明顯，IBD活動期患者的血清TREM-1水平明顯高于健康體檢者，這與之前的研究結果相符[9,15]。本研究發現UC患者血清TREM-1水平與WBC、CPR、ESR的水平呈正相關，而CD患者血清TREM-1水平只與WBC呈正相關，與Park等[15]的研究結果不相符。另外本研究還發現血清TREM-1水平與臨床上普遍認可的判斷IBD活動度的CALP水平有很好的相關性。CD活動期、UC活動期患者血清TREM-1水平顯著高于緩解期和普通腹瀉患者、健康體檢者，與疾病活動程度明顯相關。以疾病活動度為變量，ROC曲線顯示，血清TREM-1水平對IBD疾病活動度具有較高的診斷效能，判斷UC活動期和CD活動期的最佳臨界點為83.091 pg/ml和 51.241 pg/ml。。

綜上所述，檢測血清TREM-1水平可助于判斷IBD的疾病活動度，具有取樣方便、靈敏度高、特異度高、可短期內重復檢測、易于被接受等優點。血清TREM-1或可為臨床診斷IBD尤其是UC活動期、病情及療效觀察提供依據。