A型肉毒毒素對帶狀皰疹后神經痛小鼠行為學反應的影響

王冬燕 李國松 湯樣華

帶狀皰疹后神經痛（postherpetic neuralgia，PHN）是帶狀皰疹最常見的并發(fā)癥之一[1]。流行病學調查資料顯示，約有20%的帶狀皰疹患者在發(fā)病后3個月報告有PHN發(fā)生，且發(fā)生率隨年齡增加而升高[2-3]。PHN因疼痛較為劇烈、病程長，導致患者伴有焦慮和抑郁等精神癥狀，嚴重影響患者的生活質量。治療主要采用抗抑郁、抗癲癇、鎮(zhèn)痛藥等，需要長期甚至終身服藥，且不良反應較多。非藥物療法如脊髓電刺激、神經阻滯與毀損、皮內注藥療法等，有嚴重并發(fā)癥的可能，且部分療法因患者個體差異而安全性和有效性不盡人意。近年來，文獻報道應用A型肉毒毒素（botulinum toxin A，BTX-A）皮下注射可有效治療PHN[4-6]。BTX-A是肉毒桿菌在繁殖中分泌的一種有毒性的蛋白質，可通過阻斷神經遞質在突觸前膜的釋放，以減輕神經病理性痛。但關于BTX-A治療PHN的作用機制尚不明確。本研究擬構建PHN小鼠動物模型，通過注射BTX-A進行干預，觀察BTX-A對PHN小鼠模型行為學反應的影響，為BTX-A臨床治療PHN提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取SPF級8周齡雄性C57小鼠（18～22 g）36只，由上海中醫(yī)藥大學動物中心提供，合格證號：SCXK（滬）2003-0003。每天光照、黑暗各12 h規(guī)律交替飼養(yǎng)，室溫25℃，濕度60%～70%。所有動物自由飲水、進食。

1.2 主要試劑和儀器 BTX-A（20170928,規(guī)格100 U/支，蘭州生物制品研究所）、紫外分光光度計（BECKMANDU800，美國BECKMAN公司）、GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-1600，上海天能科技有限公司）、顯微鏡（日本OLYMPUS公司）、Odyssey紅外成像系統(tǒng)（LI-COR，日本OLYMPUS公司）。

1.3 動物模型的建立與小鼠分組 小鼠腹腔內注射1%戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg麻醉后，將左下肢和背部用化學脫毛劑脫毛并用清水沖洗脫毛部位。3 d后，選取脫毛區(qū)光滑無損傷動物進入實驗，皮膚損傷的動物剔除，以同等數量的小鼠補齊。然后分別于每只小鼠左下肢脛骨局部處用微量加樣器皮下接種Ⅰ型單純皰疹病毒（HSV-1）10 μl（濃度1×106PFU/ml）。選擇造模成功的PHN小鼠36只，隨機分為3組，即對照組、BTX-A組和背根神經節(jié)（DRG）/BTX-A組，每組12只。在皰疹局部注射0.9%氯化鈉注射液1 ml為對照組，皰疹局部和第5腰椎DRG處注射BTX-A（2 U/ml）1 ml為BTXA組和DRG/BTX-A組，1次/d，連續(xù)7 d。

1.4 行為學測試 分別于注射前（Z0）和注射后第1、3、5、7 天（Z1、Z3、Z5、Z7）觀察各組小鼠疼痛行為學反應，檢測機械痛閾值和熱痛閾值。

1.4.1 機械痛閾值檢測 采用von Frey測試小鼠縮足機械痛閾值：將小鼠隨機置于底部為鐵絲網（網格孔徑為1 cm×1 cm）的鼠籠內，待小鼠在籠中適應30 min后，采用von Frey纖維絲以從低到高的力度（力度梯度：0.4、0.6、1.0、1.4、2.0、4.0、6.0、8.0 g）垂直刺激小鼠雙側后足足底中部。首先選用2.0 g力度的細絲，當該力度的刺激不能引起陽性反應（抬足或舔足行為）時，則給予相鄰的大一級力度的刺激；若為陽性反應則給予相鄰小一級力度的刺激，每只小鼠連續(xù)刺激5次，每次間隔10 s，5次刺激中有3次出現陽性反應則記為陽性結果，取出現3次陽性反應中的最低刺激力度則記為該小鼠機械痛閾值。

1.4.2 熱痛閾值檢測 將各組小鼠依次置于熱痛閾檢測盒中，待其安靜后，打開輻射光源，依次在其足趾與足掌上選擇3個照射點，每個間距0.2 cm，每次照射間隔時間3 min。當小鼠出現嘶吼、舔足、甩尾及彈腿任一行為時記錄所需照射的時間。3個照射點的平均值為小鼠最終熱痛閾值。每次照射時間均不能＞30 s，防止長時間照射導致熱燙傷。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內不同時間點比較采用重復測量數據的方差分析，兩兩比較采用Bonferoni校正的t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠機械痛閾值檢測結果比較 與Z0時比較，對照組在 Z1、Z3、Z5、Z7時的機械痛閾值均無明顯改變，差異均無統(tǒng)計學意義（均 P ＞0.05）。在 Z0、Z1、Z3時，3組間機械痛閾值比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。在Z5和Z7時，BTX-A組和DRG/BTX-A組小鼠機械痛閾值均明顯高于對照組（均P＜0.05），但BTXA組、DRG/BTX-A組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。提示BTX-A能提高小鼠的機械痛閾值水平。

2.2 3組小鼠熱痛閾值檢測結果比較 與Z0時比較，對照組在 Z1、Z3、Z5、Z7時的熱痛閾值均無明顯改變，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。在Z0、Z1時，3組間熱痛閾值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在Z3、Z5和Z7時，BTX-A組和DRG/BTX-A組小鼠熱痛閾值均明顯低于對照組（均P＜0.05），但BTX-A組、DRG/BTX-A組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。提示BTX-A能降低小鼠的熱痛閾值水平。

表1 各組小鼠不同時間點機械痛閾值變化（g）

3 討論

國內外文獻報道，目前臨床上應用BTX-A治療PHN鎮(zhèn)痛效果明顯，是一種潛在的可用于治療PHN的可靠方法[7-8]。但是作為一種運動神經的特異性阻滯劑，BTX-A治療PHN的內在機制仍不清楚。因此，需要大量的基礎及臨床研究來揭示BTX-A治療PHN的作用機制，以更準確和更有效地指導臨床治療。

本研究采用脛骨局部處用微量加樣器皮下接種注射HSV-1成功完成了PHN動物模型，該方法具有損傷小、操作簡單便捷、可重復性高等優(yōu)點，且注射后產生的局部機械痛閾值和熱痛閾值變化更接近人體的病理過程，與文獻報道相符[9]。故該動物模型用于本實驗研究具有良好的可行性和確切性。

研究認為PHN主要是因三叉神經分支或脊髓神經節(jié)的神經胞體損傷所導致患者痛覺及其敏感度增加，出現疼痛劇烈不適反應[10]。實驗研究還發(fā)現神經病理性疼痛發(fā)生發(fā)展過程中，脊髓內炎癥小體核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1和半胱氨酸蛋白酶-1的激活促進了脊髓IL-1β的成熟釋放，維持了中樞敏化以及神經炎癥，進而表現為機械痛和熱痛的過敏反應[11]。行為學反應是動物疼痛刺激的主要表現，而機械痛閾值和熱痛閾值是疼痛行為學反應的主要檢測指標，目前已經廣泛應用于病理性神經痛實驗研究中[12-13]。本實驗機械痛閾值及熱痛閾值檢測結果分析顯示，皰疹局部注射BTXA和第5腰椎DRG處注射BTX-A組相比較于局部注射0.9%氯化鈉注射液，機械痛閾值明顯升高，熱痛閾值明顯下降，且隨時間的延長，效果表現也越明顯，說明BTX-A可以有效改善PHN產生的自發(fā)性疼痛行為。

表2 各組小鼠不同時間點熱痛閾值變化（s）

綜上所述，BTX-A對PHN小鼠模型具有治療作用，本研究結果為BTX-A臨床治療PHN提供了實驗基礎。