circRNA作為ceRNA調控miRNA在肺動脈高壓中的作用與機制

呂婷婷，于浩瀅，任淑月，王景蓉，孫 嵐，杜冠華

(中國醫學科學院、北京協和醫學院藥物研究所藥物篩選研究中心，藥物靶點研究和新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

肺動脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一種慢性進行性疾病，可能是多種不明病因引起的原發性疾病，也可能是心肺功能異常相關疾病的并發癥，其病因復雜，發病率和死亡率高[1-2]；PAH定義為靜息時通過右心導管測量的平均肺動脈壓 ≥ 3.325 kPa，肺毛細血管楔壓 ≤ 1.995 kPa。PAH以肺動脈增生、血管重構和血管收縮為關鍵特征，隨著肺血管阻力及肺動脈壓的進行性升高，最終導致右心衰竭和死亡。

肺動脈平滑肌細胞(pulmonary artery smooth muscle cell，PASMC)、肺血管內皮細胞和肺成纖維細胞是構成肺血管壁的主要細胞，這些細胞結構和功能的異常變化是導致血管重構和血管收縮的主要原因[3]。與PAH血管重構的特定特征包括肺遠端小動脈的肌肉化、內皮細胞的功能失調、PASMC的增殖和凋亡、血管周圍炎癥以及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)蛋白的沉積[4]。盡管近年來在藥物治療方面有所進步，但是PAH患者的生存率仍低下。

隨著“組學”研究的進展，基于核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)的PAH分子機制逐漸被發現。進一步研究PAH的發病機制及嘗試新的治療方法逆轉血管重構進而阻斷PAH進展，可能將有助于提高患者的生活質量及生存率。

1 circRNA的生物學特性

環狀RNA(circular RNA，circRNA)是非編碼RNA家族的新成員，其特征是共價閉環結構而沒有5′末端帽或3′末端多聚(A)尾。最初，circRNA被認為是正常剪接過程的無功能副產物；隨著第二代測序的出現，人們發現circRNA廣泛分布于各種細胞類型的穩定實體中，并以物種、組織、疾病和發育階段特異性的方式表達[5]。

circRNA具有多種生物學功能。位于細胞核中的circRNA可能參與轉錄的調控和選擇性剪接[6]；circRNA還可以被翻譯成蛋白質；其中，最被廣泛研究的功能是其作為微小RNA(microRNA，miRNA)海綿發揮作用的能力。circRNA分子富含miRNA應答元件，可通過與miRNA發生海綿作用，減輕miRNA對靶基因的抑制效果，上調靶基因的表達。相較于其他類型的內源性RNA(competitive endogenous RNA，ceRNA)，circRNA在細胞中表達量高且穩定性強，并具有更多與miRNA結合的位點，能夠更加快速、穩定地結合或釋放大量miRNA，高效發揮其調控miRNA的作用，比線性的ceRNA更具有突出的ceRNA活性。circRNA也可能是細胞外miRNA海綿，其可能存在病毒miRNA的結合位點，進而與病毒miRNA結合，破壞免疫應答[7]。研究circRNA這一獨特的功能為我們對PAH等心血管疾病潛在的分子生物學機制的理解，以及新型診斷生物標志物和創新治療策略的可能性提供新的方向。

2 circRNA參與PAH形成

2.1 circRNA參與PAH形成的NRG-1相關信號通路神經調節蛋白-1(neuregulin-1，NRG-1)在血管的生理病理學中起著重要作用。研究發現，在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以誘導大量表達的NRG-1被蛋白水解酶切割，釋放其表皮細胞生長因子樣序列的細胞外結構域(extracellular domain，NRG-1-ECD)和高度保守的細胞內結構域(intracellular domain，NRG-1-ICD)來調節VSMC表型。首先，NRG-1在血管內皮細胞和VSMC中表達，其受體定位于底層VSMC中[8]；其次，NRG-1-ECD是一種生物活性片段，可與ErbB家族受體酪氨酸激酶結合以激活靶細胞中的ErbB信號傳導[9]；第三，TGF-β1和血小板衍生的生長因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是影響VSMC分化的2種關鍵細胞因子[10]，分別增加和減少NRG-1-ICD的表達[11](Fig 1)。

Fig 1 NRG-1 could be cleaved into NRG-1-ECD and NRG-1-ICD under the stimulation of TGF-β1 to regulate the VSMC phenotype. In nucleus, NRG-1-ICD induced the formation of circACTA2 and up-regulated the expression of α-SMA; in cytoplasm, NRG-1-ECD reduced the phosphorylation level of ErbB receptor. NRG-1: Neuregulin-1; TGF-β1: Transforming growth factor-β1; Ang Ⅱ: Angiotensin Ⅱ; α-SMA: smooth muscle actin α; IKZF1: IKAROS family zinc finger 1; VSMC: vascular smooth muscle cell.

2.1.1circNRG-1/miR-193b-5p/NRG-1 NRG-1/ErbB信號傳導是調節血管重構的重要潛在機制。Grant等[12]指出，調節ErbB信號通路可導致細胞凋亡增加和克隆形成生存的喪失，并且細胞增殖也已被證明與PAH有關。在血管重構的早期階段，低濃度的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)可能會抑制小鼠VSMC中circNRG-1的表達。下調的circNRG-1充當miR-193b-5p的海綿或ceRNA，顯著提高miR-193b-5p的水平；miR-193b-5p通過靶向其3′-非翻譯區(untranslated regions，UTR)抑制VSMC中NRG-1的表達[8]。NRG-1-ECD的低表達通過降低ErbB受體的磷酸化水平，降低VSMC的凋亡基因cleaved-caspase-3和bax，并增加抗凋亡基因bcl-2的表達水平，從而抑制細胞凋亡[8]。而NRG-1過表達可以逆轉Ang Ⅱ對VSMC凋亡的抑制作用。

2.1.2circACTA2/miR-548f-5p/α-SMA 平滑肌α-肌動蛋白(smooth muscle actin α，α-SMA/Acta2)是VSMC收縮機制的關鍵組成部分，對血管壁穩態所需的肌動蛋白細胞骨架動力學至關重要。α-SMA表達的細微變化可能會對正常的血管功能產生影響，并促進血管疾病的進展。在VSMC的細胞質中，NRG-1-ICD通過與α-SMA相互作用，參與絲狀肌動蛋白的形成，參與細胞骨架的組成，增強VSMC的收縮[11]；而NRG-1-ICD被TGF-β1刺激后轉移到細胞核中[11]，通過募集鋅指轉錄因子-IKZF1并形成穩定的轉錄復合物，該復合物與Acta2基因的第一個內含子相互作用，誘導circACTA2形成[13]。充當海綿結合miR-548f-5p的circACTA2與靶向α-SMA 信使RNA(messenger RNA，mRNA)3′UTR的miR-548f-5p相互作用，減輕miR-548f-5p的抑制作用，上調α-SMA的表達，從而促進VSMC中的應力纖維形成、細胞收縮和內膜增生[11, 13]。同時，α-SMA在細胞質中以更高的水平表達并與NRG-1-ICD相互作用。

2.2 circRNA參與PAH形成的STIM1相關信號通路PDGF刺激可以上調circ-SATB2和基質相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)的表達，但抑制miR-939的表達。miR-939在circ-SATB2(由SATB2基因產生)上具有多個結合位點，STIM1是miR-939的重要靶基因。研究發現，circ-SATB2與VSMC的表型調節密切相關，在增殖型VSMC中circ-SATB2被上調，而在收縮型VSMC中被下調。增殖型VSMC中上調的circ-SATB2充當miR-939海綿，抑制miR-939的轉錄活性并上調 STIM1的表達[14](Fig 2)。但circ-SATB2線性序列不能阻斷miR-939對STIM1表達的抑制作用。

Fig 2 circ-SATB2 was up-regulated and the expression of STIM1 was up-regulated in the proliferative VSMC, which inhibited the expression of SM22α. STIM1 was closely related to the proliferation and differentiation of VSMC. STIM1 could promote Akt/mTOR pathway activation, significantly increase SOCE, activate CREB phosphorylation, and promote cell proliferation and migration. STIM1: Stromal interaction molecule 1; SOCE: store-operated calcium entry; CREB: cAMP response element binding protein; SM22α: smooth muscle 22alpha.

STIM1與VSMC的增殖分化密切相關。STIM1的過表達可以促進Akt/mTOR途徑的活化，導致VSMC生長速度加快，促進其增殖和PAH形成[14]。研究證明，STIM1和Orai1是高度Ca2+選擇性SOCE電流I(CRAC)的基本成分；VSMC中敲除STIM1或Orai1的蛋白后，鈣庫調控鈣離子通道(store-operated calcium entry，SOCE)顯著降低，可顯著抑制Ang Ⅱ介導的Ca2+流入、VSMC增殖和對PDGF的趨化性遷移[15]。此外，針對STIM1的RNA干擾還可以通過抑制環磷酸腺苷應答元件結合蛋白的磷酸化，抑制VSMC增殖和新內膜形成[14]。

平滑肌22α(smooth muscle 22 alpha，SM22α)蛋白，又稱轉凝蛋白，是收縮型VSMC重要的骨架相關蛋白，是VSMC分化標志物。研究發現，過表達circ-SATB2可以抑制SM22α的表達，并促進細胞的增殖和遷移[14]。而miR-939具有相反的作用，可以促進細胞凋亡并抑制細胞增殖和遷移，靶向circ-SATB2的小干擾RNA具有類似的作用。

2.3 circRNA參與PAH形成的細胞周期調控通路研究發現，circ-calm4、circ_0016070、circ_0026480和circ_Lrp6等circRNA可以通過調節細胞周期來調節PASMC的增殖和新內膜增生(Fig 3)。

Fig 3 circRNA could regulate VSMC proliferation by regulating cell cycle. circ-calm4/miR-337-3p, circ_0016070/miR-942-5p, circ_0026480/miR-27a-3p, and circ_Lrp6/miR-145 regulated cell cycle by targeting Myo10, CCND1, ATXN1, SMA, and TAGLN, respectively. Myo10: Myosin 10; CCND1: Cyclin D1; ATXN1: Ataxin1; SMA: Smooth muscle actin; TAGLN: Transgelin.

2.3.1circ-calm4/miR-337-3p/Myo10 肌球蛋白10(myosin 10, Myo10)是細胞骨架的組成成分，為細胞運動、胞內物質傳輸、胞質分裂、有絲分裂等提供所需的力，可以調節細胞間信號傳遞、指導向化性遷移和細胞形狀改變等。在小鼠低氧肺組織中，通過生物信息學和實時熒光定量PCR的篩選顯示，鈣調蛋白4基因(指定為circ-calm4)的可變剪接產生的circRNA明顯升高；上調的circ-calm4可以作為miR-337-3p的海綿，吸附并抑制miR-337-3p與Myo10 mRNA的3′-UTR結合，明顯提高Myo10的表達水平[16]，進而通過調節細胞周期來調節PASMC的增殖。而miR-337-3p抑制缺氧性PASMC的增殖。

2.3.2circ_0016070/miR-942-5p/CCND1 細胞周期蛋白D1(cyclin D1, CCND1)充當“有絲分裂傳感器”，調節細胞周期進程，控制細胞從G1到S期的轉變。研究發現，CCND1通過促進G1/S期過渡而參與結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)的功能，從而促進PASMC的增殖和PAH的發生[1]。氣管內給予CCND1或CTGF 短發夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)可明顯逆轉PAH患者的病情進展。

CCND1被鑒定為miR-942的候選靶基因，miR-942模擬物可以抑制野生型CCND1 3′UTR；circ_0016070通過使miR-942-5p海綿化，增強CCND1的表達[1]，減少G1/G0期停滯的細胞數量，進而增加細胞活力，促進PASMC的體內外增殖，與PAH中的血管重構相關。

2.3.3circ_0026480/miR-27a-3p/ATXN1 紫杉醇1(Ataxin1, ATXN1)可使微管穩定，并抑制細胞的有絲分裂和誘導細胞凋亡，有效抑制細胞的增殖。在慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)患者外周血樣本中發現，circ_0026480的表達被下調，海綿化吸附的miR-27a-3p減少，從而增加miR-27a-3p的表達水平；而ATXN1是上調的miR-27a-3p的靶基因[17]，ATXN1的表達降低會促進細胞增殖等。

2.3.4circ_Lrp6/miR-145/SMA/TAGLN 脂蛋白受體6(lipoprotein receptor 6，Lrp6)是在血管中高度表達并與血管病變相關的基因，circ_Lrp6由Lrp6的選擇性剪接而成。在鼠類和人類血管疾病中發現，circ_Lrp6與miR-145結合與未結合的比例在調節VSMC表型等血管發病機理中起作用。一項研究發現，病毒轉染circ_Lrp6 shRNA可預防小鼠頸動脈內膜增生[10]。當circ_Lrp6沉默時，可以釋放被吸附的與增殖分化表型相關的miR-145，降低VSMC分化標志物平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)和轉膠蛋白(transgelin，TAGLN)的表達，導致細胞遷移能力明顯降低，同時降低細胞周期S期中VSMC的百分比，從而抑制其增殖[10]。而circ_Lrp6的過表達能抑制miR-145的表達，恢復受RNA水平調節的miR-145靶標的表達，例如SMA、TAGLN1和賴氨酰氧化酶，從而重建原發性VSMC的增殖能力以及遷移和分化狀態。

2.4 circRNA參與PAH形成的血管炎癥相關通路炎癥在PAH形成的肺血管重構中發揮重要作用，如引起內皮細胞功能紊亂、PASMC增殖及成纖維細胞肌化；損傷的血管細胞及活化的血小板可進一步產生炎癥因子，正反饋促進血管炎癥反應，進一步加重PAH的進程[18]。研究發現， circ_0029642和circ-Sirt1等circRNA介導了PAH的發生,見Fig 4。

Fig 4 circ_0029642 and circ-Sirt1 mediated PAH by participating in vascular inflammation-related pathways; circ_0022342, circ_0002062, circ_004592 and circ_018351 participated in pulmonary vascular remodeling through mediating cancer-related pathways; in addition, circRNA via HIF-1, ATP2A2, KLF4 and AMOTL1 key molecules had important regulatory effects on PAH formation. SIRT1: sirtuin1; CDK6: Cyclin dependent kinase 6; CRKL: CRK like proto-oncogene; HIF-1: Hypoxia-inducible factor 1; KLF4: Kruppel-like factor 4.

2.4.1circ_0029642/miRNA 先心病伴PAH患者的肺血管內皮細胞在高血流及高血壓所產生的剪切力的作用下, 內皮細胞損傷，導致血小板黏附及激活凝血途徑和炎癥反應，從而導致內皮細胞中RNA編碼酶-腺苷脫氨酶1(adenosine to inosine acting on RNA enzyme 1，ADAR1)升高[19]，與circRNA呈負相關的ADAR1導致circ_0029642的表達降低。circ_0029642是由位于13號染色體的CRYLl基因編碼的，具有促進細胞代謝，抑制細胞增殖的作用。下調的circ_0029642吸附miRNA的海綿作用減弱, 導致miRNA(如miR-410)升高，最終導致內皮細胞增殖，肺血管重構[19]。

2.4.2circ-Sirt1/miR-132/212/SIRT1 circ-Sirt1(circ_0093887)由沉默信息調節因子2相關酶1(sirtuin1，SIRT1)基因外顯子2～7共價閉合環化而成，參與VSMC炎癥反應和新內膜增生。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活，包括核易位和翻譯后修飾，是VSMC炎癥表型的標志和關鍵步驟。circ-Sirt1在收縮型VSMC中高表達；在VSMC的細胞質中，circ-Sirt1以序列依賴性方式與腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)誘導的核易位直接相互作用形成circ-Sirt1-NF-κBp65失活復合物。同時，過表達的circ-Sirt1還可以作為miR-132/212的miRNA海綿，干擾SIRT1 mRNA，并促進宿主基因SIRT1的表達[20]。升高的SIRT1與核NF-κBp65相互作用，并通過對TNF-α響應而使p65脫乙酰化來抑制NF-κB的轉錄活性，從而抑制VSMC的炎癥表型轉換，改善損傷誘導的血管炎癥和新內膜形成[21]。而在炎癥刺激和新內膜增生狀態下circ-Sirt1在收縮型VSMC中的表達下調[20]。

2.5 circRNA參與PAH形成的癌癥相關信號通路當受到病毒感染或理化因素刺激時，癌基因被激活而異常表達，其表達產物一般為生長因子或生長因子受體，進而導致細胞過度增生甚至癌變。circ_0022342、circ_0002062 、circ_004592和circ_018351等circRNA通過介導癌癥途徑參與肺血管重構(Fig 4)。

2.5.1circ_0022342/miR-940/CRKL PAH患者血液樣本中circ_0022342表達下調；下調的circ_0022342可以充當miR-940海綿，上調miR-940的表達，而降低ErbB受體的磷酸化水平，導致CRK樣原癌基因(CRK like proto-oncogene，CRKL)的表達上調[22]。研究發現，過表達的CRKL可以促進細胞增殖和PAH的發生。

2.5.2circ_0002062/miR-942-5p/CDK6 在CTEPH患者中，表達下調的circ_0002062可以充當miRNA海綿，上調miR-942-5p的表達[22]。miR-942可以通過直接抑制TLE1、GSK3β和sFRP4基因的表達來激活Wnt/β-catenin通路，而細胞周期蛋白依賴性激酶6(cyclin dependent kinase 6, CDK6)富集的與此類癌癥相關的途徑和軸突引導可能與CTEPH相關。

2.5.3circ_004592/miR-152 miR-152是一種腫瘤抑制因子，可以通過靶向Wnt1、PIK3CA、DNMT1和PTEN基因來抑制細胞的增殖、侵襲和遷移。生物信息學工具分析顯示，在缺氧誘導的PAH小鼠肺組織中，上調的circ_004592可抑制miR-742-3p、miR-6373、miR-880-5p、miR-298-3p和miR-152-3p的表達水平，促進miRNA的靶向基因的表達，進而調控腫瘤通路、PI3K-Akt信號傳導通路和肌動蛋白骨架等，促進增殖，并抑制肺動脈中內皮細胞、PASMC和成纖維細胞的衰老和凋亡[23]。

2.5.4circ_018351/miR-207/665 PAH小鼠肺組織中下調的circ_018351可以增加miR-6992-3p、miR-5133、miR-6936-5p、miR-7015-3p、miR-207和miR-665的表達水平，降低miRNA靶向基因的表達，進而調控癌癥途徑、PI3K-Akt信號傳導途徑、肌動蛋白細胞骨架、癌癥中的蛋白聚糖和MAPK信號傳導途徑，抑制內皮細胞、PASMC和成纖維細胞的凋亡，進一步增加肺血管的壓力[23]。

2.6 circRNA參與PAH形成的其他相關信號通路除上述信號傳導通路外，circRNA通過缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)、ATP酶肌漿/內質網Ca2+轉運2(ATP2A2)、Kruppel樣因子4(Kruppel-like factor 4，KLF4)、血管抑素結合蛋白樣蛋白1(angiomotin like protein 1，AMOTL1)等關鍵分子對PAH的形成也有著重要調節作用(Fig 4)。

2.6.1circ_0010729/miR-186/HIF-1α HIF-1由 HIF-1α和 HIF-1β兩個亞基組成。HIF-1α與缺氧誘導的細胞凋亡密切相關，可以調控一些對細胞適應性有著重要影響的miRNA，同時miRNA也可以作用于HIF-1α[24]。在缺氧誘導的人血管內皮細胞中，circ_0010729明顯上調。功能獲得實驗證明circ_0010729的表達增加，可以使miR-186海綿化，導致miR-186的下游靶基因HIF-1α表達增加，進而顯著促進增殖和遷移活性，并抑制細胞凋亡[25]。

2.6.2circ_0046159/miR-1226-3p/ATP2A2 ATP2A2是一種鈣泵，維持細胞內鈣離子信號傳導，基因突變后細胞間黏附功能受損；氣管內遞送基因ATP2A2的霧化導致較低的肺血管阻力，并有較好的長期生存趨勢[26]。而miR-1226可以促進細胞凋亡。PAH患者外周血樣本中circ_0046159的表達顯著增加，通過海綿miR-1226-3p，降低miR-1226-3p的表達，并上調靶基因ATP2A2的表達來增加PASMC的收縮、遷移，并抑制其凋亡，從而參與PAH的發展[17]。

2.6.3circ AMOTL1as/miR-103/107/KLF4/AMOTL1 KLF4是含有3個鋅指結構的轉錄因子，參與不同的細胞信號通路，參與細胞的增殖分化，在血管重構過程發揮重要的轉錄調控作用。研究發現[27]，circ AMOTL1as存在多個與miR-103/107種子序列結合的位點。在血管內膜損傷后，作為海綿體的circ AMOTL1as表達明顯下調，釋放出所吸附的miR-103/107，進而抑制下游靶基因KLF4的表達。研究還發現，Hippo信號通路是一條細胞抑制生長性信號通路，其關鍵蛋白——AMOTL1的基因啟動子上存在多個KLF4結合位點。下調的KLF4能降低AMOTL1基因的轉錄，解除對增殖相關基因的抑制，進而促進VSMC的增殖、遷移和血管重構。此外，下調的KLF4還能降低circ AMOTL1as基因的表達，導致circ AMOTL1as-miR-103/107-KLF4形成反饋調節[27]。

文中circRNA作為ceRNA對信號通路和肺血管重構的作用列于Tab 1。

Tab 1 Signaling pathways regulated by circRNA as a ceRNA involved in pulmonary vascular remodeling

3 小結與展望

circRNA由于其獨特的功能，目前已成為心血管領域的前瞻性研究方向。Li等[28]提出心臟相關的circ_000203作為內源性miR-26b-5p和miR-140-3p海綿，上調轉錄因子Gata4的表達，加劇心臟肥大和心功能損傷；主動脈瘤患者組織中circ-000595的表達水平更高，敲除circ-000595可以上調miR-19a的表達，減弱缺氧誘導的人主動脈平滑肌細胞凋亡[14]。此外，circRNA的組織特異性和穩定性使其有可能成為一種良好的生物標志物。據報道，circSERPINE2和circ_Atp9b可作為骨關節炎生物標志物[29]；circ_100338、circ_“——”: There are no reports of circRNA-regulated targets or target signaling pathways involved in pulmonary vascular remodeling 102958、circ-MYLK、circHIPK3和circDLGAP4、circHECTD1、CIRC-Ankib1和circZNF609在診斷和治療惡性腫瘤及神經系統疾病中是很有價值的生物標志物。不僅如此，人造circRNA海綿也具有廣泛的潛在應用價值。Jost等[30]設計了靶向miR-122的人造circRNA海綿，其可以有效抑制丙肝病毒細胞培養系統中病毒蛋白的產生。

綜上所述，circRNA充當miRNA海綿，通過與miRNA相互作用從而調控miRNA靶基因的表達，這豐富了人們對動物自然進化的認知，顛覆了RNA僅僅是DNA與編碼蛋白之間的平凡使者的傳統理念。circRNA與PAH的形成密切相關，通過與關聯的miRNA相互作用，在PAH等心血管疾病的發生和發展中起著關鍵的調節作用，有望成為新型的PAH臨床診斷標志物，在防治領域展現出光明的應用前景。