硝苯地平中雜質的遺傳毒性(Q)SAR 評價及Ames試驗研究

曲見松，張 娟，耿 雪，魏 霞，祝清芬

(山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥監局仿制藥研究與評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

藥品雜質限度控制是藥物質量標準研究的重要內容[1]。近年來，國際上對藥物雜質的遺傳毒性越來越重視，EMA、美國FDA 等先后頒布了遺傳毒性雜質(genotoxic impurities，GTIs)控制的指導原則[2-4]，2014年，ICH 正式發布了M7 指導原則：為控制潛在的致癌風險的DNA 反應性(致突變性)藥物雜質的評價和控制，對具有DNA 活性(致突變性)的雜質的控制提出了通用的要求，目前已在各成員國藥品注冊中使用[5]。

硝苯地平用于預防和治療冠心病心絞痛，特別是變異型心絞痛和冠狀動脈痙攣所致心絞痛。還適用于各種類型的高血壓，對頑固性、重度高血壓也有較好療效。由于能降低后負荷，對頑固性充血性心力衰竭亦有良好療效。目前是臨床最常用的藥物之一。硝苯地平質量標準中，收載了雜質Ⅰ和雜質Ⅱ兩個已知雜質[6]。按照ICH M7 指導原則的要求，采用(定量)構效關系計算機模型[(Q)SAR]技術對硝苯地平的已知雜質進行了篩查。并對預測為陽性的雜質進一步采用體外試驗，用細菌回復突變試驗(Ames試驗)對其致突變性進行了確證。

1 材料與方法

1.1 遺傳毒性(Q)SAR 評價模型

1.1.1Derek 版本：Derek Nexus: 6.0.1，數據庫：Derek KB 2018 1.1，數據庫版本：1.1，數據庫日期：2017年11月23日，英國Lhasa公司研制(http://www.lhasalimited.org/)。Derek用于雜質遺傳毒性預測，基本設置為：物種設為細菌(bacterium)，預測終點設置為遺傳毒性(genotoxicity)項下的致突變性(mutagenicity)。

1.1.2Sarah 版本：Sarah Nexus: 3.0.0，模型：Sarah Model 2.0，模型版本：2.0。英國Lhasa公司研制(http://www.lhasalimited.org/)。

1.1.3Nexus 版本：Nexus: 2.2.1，英國Lhasa公司(http://www.lhasalimited.org/)旗下Derek、Sarah、Vitic、Meteor、Zeneth等軟件的整合平臺。

在Nexus 系統中，使用Derek 和Sarah 進行遺傳毒性評價，也可以分別使用2 個軟件。同時，Nexus 系統中已固化了組合的ICH M7 模式(ICH M7 prediction)，并能夠采用ICH M7 分類模式(ICH M7 batch classifcation)對雜質遺傳毒性進行預測和分類。

1.2 菌株鼠傷寒沙門菌TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535，均購自上海寶錄生物科技有限公司。經鑒定符合要求。

1.3 試劑和藥品硝苯地平雜質Ⅰ(含量99.3%， 30 mg/支，中國食品藥品檢定研究院)，硝苯地平雜質Ⅱ(含量99.7%，30 mg/支，中國食品藥品檢定研究院)，代謝活化系統S9(批號：3516，誘導劑及動物品種：Aroclor1254誘導♂ SD大鼠，上海寶錄生物科技有限公司)，6-磷酸葡萄糖(批號：LAZ0O01，北京百靈威科技有限公司)；NADP(批號：20120927國藥集團化學試劑有限公司)；營養肉湯培養基(批號：3302027，廣東環凱微生物科技有限公司)；瓊脂粉(批號：20150606，北京奧博星生物科技有限責任公司產品)，敵克松(Dexon，批號：10112926，上海晶純試劑有限公司)；環磷酰胺(CP，批號：SLBG4216V, ：SIGMA-ALDRICH公司)，注射用絲裂霉素(批號：131101, 浙江海正藥業股份有限公司)，2-氨基芴(批號：13152，上海晶純試劑有限公司)，1,8-二羥基蒽醌(批號WXBB7902V，美國SIGMA-ALDRICH公司)；滅菌注射用水(批號：14052501，河南省康華藥業股份有限公司。)

1.4 (Q)SAR評價方法采用Chemdraw 12.0 繪制藥物(API)及雜質的化學結構圖，分別為硝苯地平及其2個雜質雜質Ⅰ、雜質Ⅱ(Fig 1)，輸入Nexus2.1.0，采用ICH分類模式進行預測。

Fig 1 Structures of nifedipine and impurities A:nifedipine; B: impurity 1, C: impurity 2

1.5 Ames試驗方法實驗采用平板摻入法。將冷凍保存的試驗菌株培養物TA97，TA98，TA100，TA102，TA1535分別接種于營養肉湯培養基10 mL，37 ℃振蕩(100次/min)培養10 h。將含0.5 mmol·L-1組氨酸-0.5 mmol·L-1生物素的頂層培養基2.0 mL分裝于試管中滅菌，50 ℃水浴中保溫，然后每管依次加入試驗菌株增菌液0.1 mL, 受試物溶液0.1 mL和S9-混合液0.5 mL(需代謝活化時)，充分混勻，迅速傾入底層瓊脂平板上，轉動平板，使之分布均勻。水平放置待冷凝固化后，倒置于37 ℃培養箱里孵育48 h，計數每皿回變菌落數。每個劑量均做3個平行板，同時設空白對照組(自發回變組)、溶劑對照組和陽性對照組。

至少在一個菌株上，在有或無代謝活化的情況下，受試物所誘發的回復突變菌落數出現濃度依賴性的增加和/或在一個或多個濃度組上出現可重復的增加，可判定為陽性結果，否則，結果為陰性[7-9]。

2 結果

2.1 (Q)SAR評價結果結果見Tab 1，雜質Ⅰ、雜質Ⅱ預測結果Derek為貌似可信的(plausible)，Sarah分別為陽性(positive)和陰性(negative)，由于警示結構不存在與硝苯地平中，分類為3類。

Tab 1 (Q)SAR prediction summary for genotoxicity of impurities

2.2 Ames試驗結果試驗結果見Tab 2、3。在加與不加代謝活化系統的情況下，硝苯地平雜質Ⅰ和雜質Ⅱ在5 000、1 000、200、40 μg/皿劑量時，對TA97a、TA98、TA100、TA102和TA1535誘導回變菌落數與溶劑對照組相比，差異均無統計學意義，且未呈現濃度依賴性增加，各試驗菌株溶劑對照組和自發回變組的回變菌落數均落在正常范圍內，陽性對照組回變菌落數均超過溶媒對照組2倍以上。說明在本試驗條件下，受試物對鼠傷寒沙門氏菌為致突變陰性。

Tab 2 Results of Ames test for impurity

Tab 3 Results of Ames test for impurity

3 討論

致突變性雜質的危害評估方法主要是通過數據庫、文獻檢索，(定量)構效關系[(Quantitative) structure-activity relationships，(Q)SAR]評估以及遺傳毒性試驗等評估方法將雜質分類，參考國際相關分類方法，根據致突變和致癌風險危害程度可將雜質分為5類，其中1、2、3 類需按照遺傳毒性雜質進行嚴格控制[10]。

采用(Q)SAR評價通過警示結構(structural alerts)預測化合物的遺傳毒性已經有30 多年的歷史[11]。ICH M7 指導原則最顯著的特點之一是引入了(Q)SAR 評價的概念。應用(Q)SAR方法進行計算機模擬，預測細菌回復突變試驗的結果時，應采用兩個互補的(Q)SAR預測方法。一個方法基于專家規則，另一個方法基于統計學。如果兩個互補的(Q)SAR方法預測結果均沒有警示結構，則可以認為該雜質沒有致突變性，不建議做進一步的檢測。已有研究對包括Derek、Sarah 等軟件組合的預測效果進行評價，Derek 和Sarah 的組合符合OECD 的認證體系，并為美國FDA等認可。

(Q) SAR評估方法是根據化合物警示結構和對細菌回復突變試驗的預測對化合物進行分類。如果雜質含有與原料藥結構無關的警示結構，但無致突變性數據，則可歸為3類；如果雜質含有與原料藥或與原料藥相關的物質相同的警示結構(例如，工藝中間體)，且該原料藥或與原料藥相關的物質經測試為無致突變性，則可歸為4類。

對于致突變性計算機評價的結果，可以進行專家分析，以確認或者否定。另外，對于應用(Q)SAR方法評估歸為3類的雜質，可以進一步開展細菌回復突變試驗。如果試驗結果為陽性，則該雜質可以歸為2類；如果試驗結果為陰性，則該雜質可以歸為5類。

本次(Q)SAR評價發現硝苯地平的2個雜質為3類遺傳毒性雜質，應根據ICH M7 指導原則的要求進行嚴格控制或進一步實驗研究提供充分的實驗數據。本試驗采用Ames試驗對雜質的遺傳毒性進行進一步驗證。試驗結果顯示，硝苯地平雜質Ⅰ、雜質Ⅱ在40～5 000 μg/皿的范圍內，在S9存在或不存在的情況下，試驗結果均為陰性。

綜上所述，本次研究的雜質Ⅰ、雜質Ⅱ均為遺傳毒性陰性，可以按照一般雜質進行控制。