MCAO大鼠皮質小膠質細胞極化的研究及腦泰方Ⅱ號的干預

張秀麗,雷 昌,劉 洋,葛金文,張君宇，任永鎮，資 冬，王 婧，朱 偉

(1.湖南中醫藥大學科技創新中心； 2.湖南省中藥粉體與創新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地；3.湖南中醫藥大學心腦疾病中西醫結合防治湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208)

缺血性卒中(ischemic stroke)約占全部腦卒中的80%～87%，其危害性廣、致殘率高[1]。小膠質細胞(microglia，MG)由于其對中樞神經系統損傷和保護的雙重作用，在缺血性卒中的防治中日益受到重視。正常情況下，MG呈靜息態，當受到外界刺激時，其迅速極化。極化的MG有兩種類型：M1型的MG可引發神經損傷、凋亡，產生并加重腦損傷，而M2型的MG可通過促進神經發生、血管生成、軸突重塑及髓鞘再生等參與腦修復，MG極化釋放的炎癥因子貫穿于缺血/再灌注損傷病理發展的全過程[2-4]。因此，調控MG極化已成為治療缺血性腦卒中的新靶點和新策略。

缺血性腦卒中(腦梗塞)屬中醫“中風”范疇，“氣虛血瘀”系其中醫病機關鍵，因此，治宜以“益氣活血”為法。課題組前期采用具有“益氣活血”作用的腦泰方治療氣虛血瘀證腦梗塞取得較好療效[5]，前期研究表明其可降低梗死患神經元損傷[6]、促進神經再生[7]，后在腦泰方基礎上加味形成的腦泰方Ⅱ號可明顯抑制體外培養的MG的M1型極化，促進M2型極化(在發表)。本文重點對局灶性腦缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠造模后1周內皮質MG極化形態與極化標志進行研究，并采用腦泰方Ⅱ號進行干預。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立84只♂SPF級SD大鼠，體質量(300±50) g，適應性喂養3 d后，隨機分為正常組(6只)、假手術組(6只)、MCAO模型組(24只)、米諾環素組(24只)、腦泰方Ⅱ號組(24只)。采用大腦中動脈線栓法復制MCAO大鼠模型，動物于清醒后2 h參照Longa的5分制法進行神經功能評分，分值在1～3分者入組，動物清醒后爬行時向右轉圈(追尾現象)，嚴重時向右跌倒，提尾時右前肢內收屈曲提示造模成功。實驗所用SD大鼠購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(湘)2016-0002，實驗動物環境設施合格證號：SYXK(湘)2009-0001。

1.2 藥物制備與給藥腦泰方Ⅱ號由黃芪、川芎、防風、地龍、白術、僵蠶組成，藥材均購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院，購置藥材選擇黃芪甲苷、川芎嗪、阿魏酸成分含量為考察指標進行藥材質量控制，經檢測每80 g復方中含有川芎嗪0.36 mg、阿魏酸2.52 mg、黃芪甲苷13.72 mg，合格的藥材經水煎醇提濃縮后制成。藥物結合前期實驗，腦泰方Ⅱ號按9.18 g·kg-1灌胃給藥；鹽酸米諾環素(M9511) , 購自Sigma公司，溶解后按50 mg·kg-1腹腔注射給藥；腦泰方Ⅱ號和鹽酸米諾環素均從造模成功后d 1即開始，連續給藥1周。

1.3 激光共聚焦觀察MCAO模型組于造模成功后于d 1、3、5、7處死大鼠，米諾環素組與腦泰方Ⅱ號組于給藥d 1、3、5、7處死大鼠，留取距額葉前端1/3～2/3處腦組織，固定后石蠟切片，免疫熒光染色(Iba1一抗，abcam ab5076； FITC二抗，abcam ab6881)，激光共聚焦(Zeiss LSM800)觀察皮質MG形態。

1.4 Real-time PCR法檢測相關基因的表達取與“1.3”相應部位的腦組織皮質提取總RNA，逆轉錄成cDNA 后，real time-PCR(Bio-Rad 7900HT)檢測M1型標志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b，M2型標志分子Arg1(精氨酸酶)、Mrc1(甘露糖受體)、Ym1(幾丁質酶)的表達。Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche，貨號：04 896 866 001)；NoVoStart SYBR qPCR SuperMix plus(NoVoprotein，貨號：E096-01A)。引物序列見Tab 1。

1.5 數據處理采用SPSS 16.0 計軟件包對數據進行統計分析，多組總體比較方差齊者用方差分析，兩兩比較用Q檢驗，方差不齊者用Tamhane檢驗。

2 結果

2.1 MCAO大鼠腦皮質MG極化形態的變化及腦泰方Ⅱ號的作用正常組與假手術組大鼠皮質區MG呈靜息態，表現為胞體較小，分支較細(如Fig 1 A、B、F、G)；與空白組比較，MCAO模型組MG胞體明顯增大、變形，突觸變短、變粗，分支減少(如Fig 1 C1、C2、C3、C4、H、I)，但從d 5開始部分MG突觸分支增加，如Fig 1C3、C4、J、K)。

經腦泰方Ⅱ號干預后d 3 MG突觸分支增加(如Fig 1D2)，從d 5～7，分支增加的MG數量增多(如Fig 1 D3、D4)，部分胞體體積呈現回縮(如Fig 1 M)。米諾環素組亦可逆轉MG胞體脹大、突觸分支減少的狀況，且在d 3效果就比較明顯(如Fig 1 E2)，但在d 5～7米諾環素促MG分支的作用有下降的趨勢(如Fig 1 E3、E4、N)。

Fig 1 Morphological changes of MG at different time points in each group (200×)A. Normal group; B. Sham-operated group; C1～C4. MCAO model group; D1～D4. minocycline group; E1～E4. Naotaifang Ⅱ group.F，G：microglia in "resting"；H, I：M1 polarized microglia with expanded cell body，short and thick synapses；J, K, M, N：Polarized microglia from M1 to M2 with increased synaptic branches, lengthen, thin.

2.2 M1型標志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b的表達變化及腦泰方Ⅱ號對M1型極化的抑制作用與假手術相比，模型組M1型標志分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b表達都明顯增加(P<0.01，Fig 2)，其中尤以MCP-1的變化最為劇烈(Fig 2C)。從時間表達軸上看，模型組MHCⅡ的表達在d 3最高，之后逐漸減少(Fig 2A)；iNOS、MCP-1與CD11b的表達在d 5達到最高，之后出現不同程度的下降(Fig 2B、C、D)。

Fig 2 MRNA expression of M1 markers MHCⅡ, iNOS, MCP-1 and CD11b in MCAO model rats n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham

與模型組相比，腦泰方Ⅱ號在d 3后可明顯降低MHCⅡ、iNOS的表達(P<0.05或P<0.01，見Fig 3A、B)，但在d 5后才對MCP-1與CD11b的表達有明顯調節作用(P<0.01，見Fig 3C、D)；米諾環素對iNOS、CD11b的調節作用從d 1差異有顯著性(P<0.05，見Fig 3B、D)，對MHCⅡ、MCP-1調節作用從d 3差異有顯著性(P<0.01，見Fig 3A、C)。

與米諾環素相比，腦泰方Ⅱ號對MHCⅡ的抑制作用在d 3明顯弱于米諾環素(P<0.05)，在d 5后雖強于米諾環素，但差異無顯著性(P>0.05，見Fig 3A)；其對iNOS、MCP-1、CD11b的抑制作用均在d 5后才優于米諾環素(P<0.05或P<0.01，見Fig 3B、C、D)。

Fig 3 Effects of NaotaifangⅡon mRNA expression of M1 markers MHCⅡ, iNOS, MCP-1 and CD11b n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham；#P<0.05，##P<0.01 vs model

2.3 M2型標志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達變化及腦泰方Ⅱ號的調節作用與假手術相比，模型組M2型標志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達在d 3、5均有明顯增加(P<0.05或P<0.01，見Fig 4)，但總體表達水平較M1型標記分子偏低。從時間表達軸上看，模型組Arg1、Ym1的表達在d 3最高，之后逐漸減少(Fig 4A、C)；而Mrc1的表達在d 5達到最高，之后出現不同程度的下降(Fig 4B)。

Fig 4 MRNA expression of M2 markers Arg1, Mrc1, Ym1 in MCAO model rats n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham

與模型組相比，腦泰方Ⅱ號在d 3后可明顯升高Arg1、Mrc1、Ym1的表達(P<0.05或P<0.01)，且在d 5達到最高點(Fig 5)。米諾環素對Arg1、Mrc1、Ym1的調節作用從d 1起即差異有顯著性(P<0.05或P<0.01)，但在3 d后其調節作用即下降。

與米諾環素組相比，腦泰方Ⅱ號雖在d 3對Arg1、Mrc1、Ym1的調節作用明顯弱于米諾環素組(P<0.01)，但在d 5～7均強于米諾環素組(P<0.01)。

Fig 5 Effects of NaotaifangⅡon mRNA expression of M2 markers Arg1, Mrc1 and Ym1 n=3)*P<0.05，**P<0.01 vs sham；#P<0.05，##P<0.01 vs model

3 討論

MG的形態與MG的功能密切相關[8]，在非病理條件下，MG處于高度分支的靜息狀態，當受到外界刺激后，MG迅速活化，并伴隨著突觸分支形態、數量，胞體體積等的變化[9]。本項研究結果表明，MCAO模型組皮質MG胞體明顯增大、變形，突觸變短、變粗，分支減少，這與Chen 等[10-11]的研究結果一致。但本研究還發現，在d 5后MCAO大鼠皮質MG有突觸分支增加、胞體回縮的趨勢，這可能與大鼠一定程度的自愈有關。與米諾環素相比，腦泰方Ⅱ號對MG極化調節有滯后性，米諾環素促MG突觸分支與數量增加的作用在d 3效果就比較明顯，但腦泰方Ⅱ號促MG突觸分支及數量增加的作用在d 5后效果才明顯。

MG表面標記分子是區分M1型與M2型MG的重要標志，其表達變化反映了M1/M2型MG在體內的動態變化過程。本項研究表明：MCAO大鼠皮質MG在造模1 d后被激活，M1/M2型標記分子的表達均增加，且不同M1/M2型標記分子的表達具有時間差異，分別在d 3或d 5達到最高點，呈現出逐步被激活的趨勢。這與Hu等[12]的研究結果一致。但在本文中CD11b的表達在造模d 5達到高點后呈現出下降的趨勢，這與Hu等[12]的研究結果“CD11b持續上升”不一致，估計可能與造模損傷的程度有關[13]。除此之外本項研究還發現，M1型標記分子在造模后均明顯增加，且分別在d 3或d 5達到最高點；而M2型標記分子在造模后d 1雖有增加，但差異并無顯著性，造模后d 3、5雖明顯增加，但在d 7后回落，M2型標記分子的表達變化(2～6倍)整體較M1型標記分子變化較小，這一結果從側面解釋了MCAO模型后1周內腦損傷的原因，且與本研究中形態學觀察結果一致。

腦泰方是課題組前期臨床研究獲得的具有“益氣活血”作用的、用于治療氣虛血瘀證腦梗塞的中藥復方，臨床藥效明顯[5]，后期在腦泰方的基礎上加入白術、防風形成腦泰方Ⅱ號。方中以黃芪作為君藥，借其力專、性走，周行全身，大補脾胃元氣，令氣旺則血活，血活則瘀除，以治其本；川芎活血行氣，白術健脾益氣，助君藥加強補氣之功，共為臣藥；防風祛風通絡，地龍、僵蠶通經活絡，共為佐藥，諸味配合，共呈益氣活血通絡之效。本研究表明，腦泰方Ⅱ號可通過明顯降低M1型標記分子MHCⅡ、iNOS、MCP-1、CD11b的表達抑制MG的M1型極化，通過促進M2型標志分子Arg1、Mrc1、Ym1表達促進MG的M2型極化。但與米諾環素相比，腦泰方Ⅱ號對MG M1/M2型極化標記分子的調節顯示出一定的滯后性，米諾環素在d 1到d 3逐步明顯激活M1型標記分子，而腦泰方Ⅱ號在d 3～5逐步明顯激活M1型標記分子；米諾環素在d 1即對M2型標記分子起明顯調節作用，但腦泰方Ⅱ號對M2型標記分子的調節作用在d 3才有顯著性；這也與本研究中形態學觀察的結果相一致。但腦泰方Ⅱ號又有自身獨特的優勢，其在d 5后對M1/M2型MG極化標記分子的調節作用均明顯優于米諾環素組，這進一步解釋了其在d 5～7，促MG分支增加和數量增多的作用逐步增強的現象。

綜上，MCAO大鼠皮質MG極化具有時序性，是一個逐步活化的過程；腦泰方Ⅱ號對缺血性卒中后皮質MG極化具有明顯的調節作用。本項研究結果將為缺血性卒中的中醫藥治療提供新的理論依據與治療靶點，后續將進一步對腦泰方Ⅱ號調節MG極化的分子機制進行研究。