大黃提取物對缺血性腦損傷大鼠細胞凋亡的抑制作用

唐宇恒，劉俊杰，黃 鑫，孫春曉，許阿娟，楊澤霖，賴文芳，洪桂祝

(福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122)

腦卒中，又稱腦中風，是一種由腦部血液循環障礙引起腦組織損傷及局灶性神經功能缺失的急性腦血管疾病。缺血性腦卒中是腦卒中的主要發病類型，約占腦卒中的87%[1]。缺血性腦卒中通常導致血管閉塞、腦缺血缺氧、腦組織壞死，最終導致神經功能障礙[2]。研究表明，缺血性腦卒中所引起的出血轉化使腦卒中的嚴重程度明顯增加[3]。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator，tPA)溶栓治療作為目前缺血性腦卒中患者的治療標準，因其治療窗窄(4.5 h)、溶栓可能導致腦內出血，使出血性轉換的風險增加等限制了tPA的臨床應用[4]。因此，目前迫切需要研發更為有效、安全地治療腦卒中的藥物。

大黃作為一種常見的傳統中藥，據《潔古家珍》中記載治療急性腦卒中所用之三化湯便是以大黃為主要成分。大黃的主要化學成分為蒽醌類、二苯乙烯類、花青素類、黃酮類、有機酸類和色素類等[5]。研究表明，大黃在腦卒中臨床上多有應用研究[6]，在腦中風后發揮抗炎和腦保護作用[7-8]。課題組前期研究發現大黃素可抑制脂多糖誘導的星形膠質細胞炎癥反應[9]；大黃苷元可通過改善腦缺血/再灌注大鼠中的腦梗死和神經元凋亡而發揮保護作用，從而能改善其神經功能[10]。因此，本文主要研究大黃提取物對缺血性腦損傷大鼠腦組織細胞凋亡的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物45只SPF級健康♂SD大鼠，體質量(260～280) g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：2015000510392，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。飼養在福建中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SYXK(閩)2014-0005。

1.2 藥物與試劑

1.2.1藥物 大黃經福建中醫藥大學中藥鑒定學教研室鑒定為蓼科(Polygonaceae)大黃屬(RheumL.)植物的干燥根莖，藥材經鑒定游離蒽醌含量約為大黃的0.5%，符合2015版藥典標準(不得少于0.20%)。

1.2.2試劑 TUNEL試劑盒(Promega，貨號G3250)；膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體(貨號ab7260)、TRITC標記羊抗兔IgG(貨號ab6718)，均購于Abcam公司；RNeasy?Mini Kit(Qiagen公司，貨號74134)；PCR引物由生工生物工程上海有限公司設計合成，IL-1β引物上游序列5′-CTGTCTGACCCATGTGAGCTG-3′，下游序列5′-TTTGTCGTTGCTTGTCTCTCCTT-3′；iNOS引物上游序列5′-CAAGCACCTTGGAAGAGGAG-3′，下游序列5′-AAGGCCAAACACAGCATACC-3′；Bax抗體(貨號2772)、Bcl-2抗體(貨號15071)、caspase-3抗體(貨號9662)、cleaved caspase-3抗體(貨號9661)，均購于Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體(碧云天生物技術有限公司，貨號AA128)。

1.3 儀器生物組織石蠟包埋機、石蠟切片機(湖北孝感亞光醫用電子有限公司)；激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司)；倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Microfuge?22R臺式微量離心機(美國Beckman Coulter公司)；ND2000C紫外可見分光光度計(美國Thermo公司)；Centrifuge 5804(R)臺式高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)；7900H-PCR儀(美國Applied Biosystems公司)；Chemi-Doc XRS+凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.4 大黃提取稱取干燥大黃根莖200 g，粉碎后置于500 mL圓底燒瓶中，加乙醇250 mL加熱回流2 h；紗布過濾提取2次，將2次濾液合并，減壓濃縮過濾，將濾液轉入蒸發皿，蒸發至無醇味，濃縮液干燥后得大黃提取物20 g固體粉末(1 g相當于10 g生藥量)；加含0.1%羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)的生理鹽水溶解，配制成30 g·L-1的混懸溶液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5 動物實驗分組及給藥45只♂SD大鼠隨機分為假手術組(sham)、模型組(MCAO)和大黃提取物組(MCAO+rhubarb extract)，每組各15只。MCAO造模2 h后，進行灌胃。給藥組灌胃給予大黃提取物200 mg·kg-1·d-1(參考60 kg成人臨床水煎液常用劑量0.33 g·kg-1·d-1，乘以醇提物約10%的提取率后折算成大鼠等效劑量)，其余組灌胃等體積的含0.1% CMC-Na的生理鹽水，連續6 d給藥。

1.6 動物實驗MCAO造模用2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)對大鼠腹腔注射麻醉后，剪開頸部皮膚，用止血鉗鈍性分離皮下組織，暴露并分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，用縫合線結扎頸總和頸外動脈，用動脈夾夾閉頸內動脈遠心端，在頸總距離頸內、頸外動脈分叉部1 cm處剪一小口，將尼龍線栓由頸總動脈推進至線栓標記黑點進入頸內動脈后離三叉處0.5 mm，結扎頸內動脈近心端以固定線栓。2 h栓塞后，拔出線栓，實現再灌注。假手術組除不進行插線栓操作外，其余操作相同。參考Zea Longa評分法，每天對動物進行神經功能評分，評分≥2分的視為實驗模型制備成功，可用于后續實驗。

1.7 TUNEL染色將制備好的腦組織切片65 ℃烘40 min后脫蠟復水，滴加新配的蛋白酶K工作液(20 mg·L-1)，室溫孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；按照試劑盒要求配制好TUNEL檢測液，在組織片上滴加適量檢測液，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加DAPI染液室溫避光孵育8 min，PBS洗3次，每次3 min，加抗淬滅劑，激光共聚焦顯微鏡下觀察，用ImageJ軟件計算各組TUNEL陽性細胞表達率。

1.8 免疫熒光染色檢測GFAP的表達大鼠給藥6 d后取腦組織，用4%多聚甲醛固定24 h；腦模具將腦組織均分為6片，之后過缸脫水、石蠟包埋及切片。腦組織切片烘干后進行脫蠟復水、熱抗原修復，冷卻后用PBS緩沖溶液清洗3次，每次5 min；滴加5%BSA室溫封閉2 h，加入一抗(GFAP抗體，1 ∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜；次日用PBS洗3次，每次10 min，加熒光二抗(1 ∶500)室溫避光孵育1.5 h，PBS清洗3次，每次5 min；滴加DAPI染液室溫避光孵育8 min，PBS洗3次，每次3 min；加熒光抗淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.9 RT-qPCR檢測IL-1β、iNOS mRNA表達按照RNeasy?Mini Kit試劑盒的描述，提取腦組織總RNA，檢測RNA濃度及純度，以A260/A280值達到1.8～2.2表示純度合格；調整各組濃度至同一水平，按逆轉錄試劑盒說明，RNA逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，通過實時熒光定量PCR儀檢測IL-1β、iNOS mRNA表達。以GAPDH為內參計算2-ΔΔCt值。

1.10 Western blot檢測GFAP、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白表達提取總蛋白，采用SDS-PAGE電泳，經兩步法將總蛋白分離后，將凝膠中的蛋白轉移至PVDF膜，5% BSA封閉2 h，加入稀釋后的一抗(GFAP抗體1 ∶10 000，Bax抗體1 ∶1 000，Bcl-2抗體1 ∶1 000，caspase-3抗體1 ∶1 000，cleaved caspase-3抗體1 ∶1 000，β-actin抗體1 ∶3 000)；放4 ℃冰箱里孵育過夜；次日，TBST清洗3次，每次10 min，加入HRP標記的二抗(1 ∶1 000稀釋)，室溫下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加ECL顯色劑經凝膠成像分析系統檢測，分析各目標條帶的灰度值，分別計算各組與β-actin灰度值的比值，并統計各組之間的差異。

2 結果

2.1 大黃提取物對MCAO大鼠TUNEL陽性細胞表達的影響與Sham組相比，經TUNEL染色，結果表明，MCAO模型組中大鼠TUNEL陽性細胞表達升高，經大黃提取物干預后，大鼠TUNEL陽性細胞表達降低，且差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1 TUNEL in MCAO rats reduced by ##P<0.01 vs sham; **P<0.01 vs MCAO

2.2 大黃提取物對MCAO大鼠GFAP表達的影響與Sham組相比，經免疫熒光染色和Western blot檢測，結果表明，MCAO模型組中大鼠GFAP表達升高，經大黃提取物干預后，GFAP表達降低，且差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 2 GFAP in MCAO rats reduced by ##P<0.01 vs sham; *P<0.05, **P<0.01 vs MCAO

2.3 大黃提取物對MCAO大鼠IL-1β、iNOS mRNA表達的影響與Sham組相比，經RT-qPCR檢測，結果表明，MCAO模型組中IL-1β、iNOS mRNA表達升高，經大黃提取物干預后，IL-1β、iNOS mRNA表達降低，且差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 3。

Fig 3 Effects of rhubarb extract treatment on IL-1β(A), iNOS(B) mRNA in MCAO rats n=3)#P<0.05 vs sham; *P<0.05 vs MCAO

2.4 大黃提取物對MCAO大鼠Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白表達的影響與Sham組相比，經Western blot檢測，結果表明，MCAO模型組中Bax、cleaved caspase-3蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達降低，經大黃提取物干預后，GFAP、Bax、cleaved caspase-3蛋白表達降低，但總的caspase-3蛋白表達無影響，Bcl-2蛋白表達升高，且差異具有顯著性(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 4 Effects of rhubarb extract treatment on Bax, Bcl-2(A), cleaved caspase-3, caspase-3(B) protein in MCAO rats n=3)##P<0.01 vs sham; **P<0.01 vs MCAO

3 討論

缺血性腦卒中引起的血管閉塞，導致腦內缺氧和能量喪失，隨后形成活性氧，釋放谷氨酸，細胞內鈣離子積累，并誘導炎癥反應。這一系列事件，稱為缺血級聯，導致不可逆轉的組織損傷[11]。本實驗采用MCAO模型模擬缺血性腦卒中，該方法無需開顱，對動物損傷小、重復性高、再灌注時間高度可控，可以較準確地模擬臨床上腦缺血病況[12]。IL-1β和iNOS是重要的促炎因子，腦中風后這些炎性細胞因子的大量產生，可以破壞神經細胞和血腦屏障以及影響神經細胞再生，促進神經炎癥反應和組織損傷[13]。同時，GFAP是星形膠質細胞的特異性標志蛋白，在病理過程中產生的炎癥因子刺激下，會引起星形膠質細胞活化并增殖，GFAP作為其膠質細胞損傷相關蛋白，腦損傷后也大量表達[14]；本實驗證實，腦損傷后IL-1β和iNOS炎癥因子基因表達顯著增加，GFAP的表達也明顯提高，并發現經大黃提取物干預后能逆轉該結果，表明大黃提取物能降低神經炎癥水平并抑制星形膠質細胞的異?；罨?。

TUNEL染色利用生化方法特異性標記凋亡細胞，將凋亡細胞與活細胞及壞死細胞區分開，適用于機制研究，是一種常見的細胞凋亡檢測方法。采用此方法檢測，結果顯示大黃提取物能顯著降低缺血性腦損傷后TUNEL的陽性表達。研究表明，caspase是細胞凋亡的關鍵介導因子，其中caspase-3是一種常被激活的死亡蛋白酶，催化多種細胞關鍵蛋白的特異性斷裂，是細胞凋亡過程最關鍵的凋亡執行蛋白酶[15]。同時Bcl-2家族是細胞凋亡的主要調控因子和介導因子，家族成員中Bax和Bcl-2是細胞凋亡過程中一對相對立的調控基因，而Bcl-2/Bax的高比值則被認為是細胞抗凋亡的關鍵因素。本次研究發現，大黃提取物能夠抑制MCAO大鼠缺血側腦組織的凋亡蛋白酶cleaved caspase-3和Bax促凋亡蛋白表達，促進Bcl-2抗凋亡蛋白的表達，從而能夠抑制MCAO大鼠腦細胞凋亡。

綜上所述，大黃提取物通過降低缺血性腦損傷后的炎癥水平，抑制缺血側腦細胞凋亡，從而發揮腦保護作用。這將為課題組下一步對大黃提取物中有效成分的提取及藥效機制研究奠定理論和實驗基礎。

(致謝：本實驗在福建中醫藥大學藥學院生物醫藥研發中心及省級中藥學重點實驗室完成，感謝所有老師及同學的支持與幫助！)