海馬區微循環障礙在蛛網膜下腔出血后認知障礙中的作用及其機制研究

周永志 張小兵 王建莉 俞學斌

動脈瘤性蛛網膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是由顱內動脈瘤破裂引起的，約占自發性SAH的80%；經過積極治療后，相當比例的患者神經功能完全康復，達到臨床上的所謂“治愈”，但近年來研究發現，半數以上的幸存者中存在不同程度及多個認知領域的功能障礙[1-3]，嚴重影響其功能預后及生活質量[4-5]。眾所周知，海馬組織在實現長期記憶、概念形成、空間導航等多種認知功能中起著至關重要的作用，海馬區損傷可導致明顯的認知障礙[6-7]。近年來研究發現，SAH患者在發病早期即存在不同程度的海馬區微循環障礙，而海馬區持續微循環障礙可導致海馬神經元凋亡壞死和海馬萎縮，進而導致相應的功能障礙[2]。但臨床上對患者發生動脈瘤性SAH后海馬區早期微循環及局部神經元損傷情況、認知障礙發生情況知之甚少。本研究首先利用CT灌注成像（CT perfusion image，CTP）對動脈瘤性SAH患者海馬區局部微循環狀況進行了測定，比較有、無認知障礙患者發病后10 d雙側海馬區微循環灌注參數；同時建立小鼠SAH模型，采用水迷宮法評估小鼠認知障礙情況并分析其與神經元凋亡的關系，現將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年1月至2019年1月紹興市人民醫院收治的138例動脈瘤性SAH患者為研究對象，均經CT或腰椎穿刺檢查證實存在自發性SAH，經CT血管成像和（或）腦血管造影檢查確定為顱內動脈瘤破裂；經開顱動脈瘤夾閉或介入栓塞治.療后預后良好，格拉斯哥結局評分4～5分。排除標準：（1）HUNT-HESS分級5級；（2）改良FISHER分級0級；（3）有神經內外科疾病史；（4）精神障礙或智力低下；（5）不能配合評估者。根據發病后6個月蒙特利爾認知評估量表（MoCA）評分，存在認知障礙（≤26分）63例，無認知障礙（＞26分）75例；兩組患者在性別、年齡、受教育年限以及動脈瘤大小、部位、治療方式等方面比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表1。本研究經醫院倫理委員會審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 CTP檢查 患者發病后10 d，采用佳能320層螺旋CT掃描儀進行常規橫斷面掃描，層厚和層間距均為2 mm；然后選取重點層面（經基底核區域為底標準層面）進行CTP掃描檢查。利用Perfusion CT隨機軟件對重組動態圖像進行后續處理，去除所有動態圖像上的顱骨輪廓；用定義CT值的方法排除腦脊液的影響，并對圖像進行平滑處理以減小噪聲，最后分析所有動態圖像并得到一系列腦灌注參數圖，包括腦血流量（CBF）、腦血容量（CBV）、對比劑平均通過時間（MTT）和達峰時間（TTP）4種圖像。由2位經驗豐富的神經影像學診斷醫生對這些圖像進行分析，選擇雙側海馬區為感興趣區，取灌注圖像中標準層面圖或包含感興趣區最完整的層面進行CBF、CBV、TTP、MTT等參數測量，見圖1（插頁）。感興趣區在2或3個層面都包含時，取其平均值，代表相應區域的局部腦血流灌注狀況。

1.3 動物實驗

1.3.1 動物分組與處理 將30只小鼠（購自浙江大學動物實驗中心）按隨機數字表法隨機分為兩組：模型組20只，假手術組10只。（1）模型組采用線栓法血管內穿刺建立SAH模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，暴露右側頸動脈及其分支。將鈍化的4-0單絲尼龍縫合線推入頸外動脈，然后通過頸內動脈，直到出現阻力。縫合線再插入約3 mm，在頸內動脈分叉處附近穿刺血管制作SAH模型。（2）假手術組在縫合線通過小鼠頸內動脈遇到阻力時，將其取出，其余步驟與模型組相同。

表1 有、無認知障礙患者一般資料比較

1.3.2 認知功能評估 采用水迷宮實驗法。建模前4 d訓練小鼠尋找水中平臺，小鼠尋到平臺后停留60 s強化記憶，建模前及建模成功后第10天利用自動攝像系統記錄小鼠尋找到平臺的時間，即潛伏時間。根據平均潛伏時間評估小鼠認知功能，＜120 s為無存在認知障礙，≥120 s為認知障礙。

1.3.3 海馬區細胞凋亡情況檢測 采用原位末端轉移酶標記技術（TUNEL）法。建模后第10天評估認知功能后，采用脊椎脫臼法處死小鼠，斷頭取腦，切取雙側海馬組織，4%多聚甲醛固定過夜，置于10%、20%和30%的蔗糖溶液進行梯度脫水，制成5 μm厚的冠狀冰凍切片。參照試劑盒說明書（C1088，北京碧云天生物技術有限公司）進行TUNEL免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察；每張切片隨機抽取5個不同的視野，使用Image J圖像分析法測定每個視野的光密度值并取平均值，即凋亡細胞數。

1.4 統計學處理 采用SPSS 23.0統計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。計數資料組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 有、無認知障礙患者發病后10 d雙側海馬區微循環灌注參數比較 與無認知障礙組比較，認知障礙組患者雙側海馬區CBF下降，MTT、TTP均明顯延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；兩組患者雙側海馬區CBV比較，差異均無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

2.2 小鼠認知功能評估結果 經水迷宮實驗評估，模型組20只小鼠存在認知障礙8只，無認知障礙12只。認知障礙組、無認知障礙組、假手術組潛伏時間分別為（160.9±38.4）、（70.9±28.2）、（63.5±35.6）s，認知障礙組較無認知障礙組明顯延長（P＜0.05），假手術組與無認知障礙組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 小鼠海馬區細胞凋亡數比較 熒光顯微鏡下可見模型組小鼠海馬CA3區存在較多細胞凋亡，而假手術組僅見少量凋亡細胞，見圖2（插頁）。與無認知障礙組相比，認知障礙組小鼠凋亡細胞數明顯增多，差異有統計學意義（P＜0.05），見表 3。

圖1 雙側海馬區CT灌注成像（CTP）圖像上腦血流量（CBF）、腦血容量（CBV）、對比劑平均通過時間（MTT）及達峰時間（TTP）參數測量

圖2 小鼠海馬區細胞凋亡情況（a：假手術組；b：無認知障礙組；c：認知障礙組；免疫熒光染色，×400）

3 討論

有臨床研究表明，海馬體與記憶、空間導航及執行力關系密切，海馬損傷可引起注意力缺陷，海馬區微循環障礙進而導致的海馬萎縮被認為是診斷阿爾茨海默病的可靠生物學標志[3]。對于SAH，近年來臨床研究和動物實驗均發現海馬區存在明顯血流灌注下降和局部腦微循環障礙[4]。Yamamoto等[5]在動物實驗中發現異氟醚誘導的小鼠持續低血壓，可導致明顯認知障礙，進一步研究發現這些小鼠海馬區存在明顯的血流灌注降低和微循環障礙，同時免疫組化染色結果顯示海馬CA1區存在明顯的神經元損傷，這表明海馬區低灌注和微循環障礙與認知障礙存在明顯相關性。Takata等[6]建立小鼠模型探討SAH后長期認知障礙的發病機制，發現與假手術組相比，SAH組小鼠水迷宮逃逸潛伏時間、游泳距離均明顯增加，病理學切片檢查顯示SAH組小鼠海馬CA1區神經元數量明顯減少，同時免疫組化染色結果也顯示海馬區存在明顯的微血管及神經元DNA氧化損傷，碳-14放射自顯影技術檢查顯示海馬區腦動脈直徑改變不明顯，但在出血早期（3～7 d）局部腦血流量明顯減少，即使14 d后局部微循環灌注仍不完全，這提示局部存在明顯的微循環障礙。以上研究結果均表明，海馬區持續微循環灌注不足以及由此導致的局部神經元數量減少在SAH后長期認知障礙中起重要作用。

表2 有、無認知障礙患者發病后10 d雙側海馬區微循環灌注參數比較

表3 3組小鼠海馬區細胞凋亡數比較

CTP是一種新的血流動力學評價技術，相關參數可以從不同角度來反映腦血流灌注情況，可以在患者出現臨床癥狀前就敏感地發現SAH導致的局部腦血流動力學異常和微循環障礙[7]。SAH患者發病后腦血管痙攣及其引發的微循環障礙一般發生在出血后4～14 d，其中第8～10天為腦血管痙攣高峰期。因此，本研究評估了動脈瘤性SAH患者發病后10 d的CTP灌注參數，結果顯示與無認知障礙組相比，認知障礙組患者海馬區多項灌注參數明顯改變，表現為CBF明顯減少，MTT和TTP明顯延長，提示局部灌注明顯不足，存在明顯的微循環灌注障礙。結合發病后6個月MoCA量表評分進一步分析，結果顯示灌注參數變化越明顯，越容易出現認知障礙。由此推斷雙側海馬區微循環功能灌注障礙與動脈瘤性SAH后認知障礙存在明顯的相關性。

但是，目前關于海馬持續微循環障礙如何導致認知障礙的發病機制尚不清楚。Lee等[8]隨訪了動脈瘤性SAH患者出血6個月后海馬區灰質體積（MRI檢查），結果發現與未破裂組相比，動脈瘤性SAH患者海馬區灰質體積明顯減少，且海馬容量減少與預后評分下降有關，提示動脈瘤性SAH可導致遠期海馬體積減少，但海馬體積減少的機制并不明確。Luo等[9]研究發現，缺牙可導致小鼠出現空間認知障礙；進一步探究發病機制發現，實驗小鼠雙側海馬區CBF降低，海馬組織中Bax/Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達升高，CA1區錐體細胞數量減少。Bax、Bcl-2是細胞凋亡的關鍵調控因子，Caspase-3是凋亡級聯反應中導致神經元凋亡的主要效應因子。該研究還認為牙齒脫落引起小鼠空間認知障礙的潛在機制與海馬CBF降低引起的局部持續微循環障礙進而導致細胞凋亡增加有關。本研究建立了小鼠SAH模型，并采用水迷宮法評價其認知功能，結果發現假手術組與無認知障礙組潛伏時間比較差異無統計學意義，而認知障礙組較無認知障礙組潛伏時間明顯延長；同時TUNEL染色結果顯示認知障礙組小鼠雙側海馬區細胞凋亡增多，提示認知障礙與海馬區神經元凋亡增加具有明顯的相關性。

結合臨床研究發現的有認知障礙的SAH患者雙側海馬區存在明顯微循環障礙，以及動物實驗發現的有認知障礙的小鼠海馬區細胞凋亡增多的結果，筆者推斷海馬區持續微循環障礙導致的局部神經元凋亡增加在SAH后認知障礙發病機制中起重要作用，理由如下：（1）海馬是對缺血最敏感的腦區之一，海馬CA1區錐體細胞數量減少和萎縮與記憶力下降有關，是阿爾茨海默病最具特征性的神經病理學損傷區域。（2）對于SAH后認知障礙，近年來臨床研究和動物實驗均發現海馬區存在血流灌注下降，低灌注是所有腦缺血病因的最后通路，當CBF低于正常水平的30%時，神經元電活動停止，在細胞器水平，線粒體氧化磷酸化停止，從而進一步引起缺血、缺氧級聯放大效應，而持續灌注不足可導致缺血敏感區神經元不可逆死亡，以后即使恢復血流，細胞也無法復活[10]。本研究發現有認知障礙的動脈瘤性SAH患者雙側海馬區CBF下降和MTT延長尤其明顯，因此認為雙側海馬區CBF和MTT的持續異常改變預示著該區域存在著持續微循環障礙，由此引起神經元凋亡增加和功能障礙最終導致了認知障礙的發生。