血管生成樣蛋白2在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)及作用研究

金緯緯 蔡平生 林一禾 鄭飛云

子宮內(nèi)膜腺癌是起源于女性子宮內(nèi)膜上皮的惡性腫瘤[1]。近年來，隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年增高。雖然目前手術(shù)及放化療在子宮內(nèi)膜腺癌的治療中取得了良好效果，但是部分患者仍存在化療毒性、腫瘤復(fù)發(fā)或放化療耐受等問題[2]。因此，探究子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞全新的特異性治療靶點(diǎn)迫在眉睫[3]。血管生成樣蛋白2（angiopoietin-like protein 2，ANGPTL2）是抑制性人白細(xì)胞免疫球蛋白樣受體家族重要成員。研究表明，ANGPTL2在腫瘤免疫反應(yīng)[4]、腫瘤細(xì)胞識別[5]、免疫逃逸[6]及血管粥樣硬化[7]等過程中發(fā)揮重要作用，且在多種腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。而在子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞中ANGPTL2的表達(dá)及其在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生、發(fā)展、放化療耐受及復(fù)發(fā)過程中的作用，相關(guān)研究報(bào)道不多。深入探討ANGPTL2在子宮內(nèi)膜腺癌中的作用及其調(diào)控信號通路，可為子宮內(nèi)膜腺癌臨床治療提供新的思路，為特異性靶向藥物研發(fā)提供新的治療靶點(diǎn)。因此，本研究分析子宮內(nèi)膜腺癌患者臨床病理資料，探討ANGPTL2表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系，及其對腺癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 組織標(biāo)本收集 選取2017年1月至2019年12月在溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院或溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院確診為子宮內(nèi)膜腺癌、行子宮全切除術(shù)的子宮內(nèi)膜腺癌組織標(biāo)本60例（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院20例，溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院40例），排除術(shù)前接受放療、化療或激素治療的患者。病理分級G1級38例，G2級16例，G3級6例；臨床分期Ⅰ期30例，Ⅱ期10例，Ⅲ期15例，Ⅳ期5例。另擇因子宮肌瘤行子宮全切除術(shù)的子宮內(nèi)膜正常組織標(biāo)本60例（溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院60例）。收集的組織標(biāo)本以凍存管分裝后立即置入液氮罐中，后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡32～60（42.5±13.6）歲；子宮內(nèi)膜正常患者年齡 40～62（45.5±15.4）歲。兩者年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。本研究經(jīng)溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器、試劑及細(xì)胞株 BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)（Experion，美國伯樂公司），曝光機(jī)（ImageQuant LAS 4000 mini Biomolecular Imager，美國 GE Healthcare公司），DMEM 培養(yǎng)基（11960044，美國Gibco公司）；1640培養(yǎng)基（31870074，美國Gibco公司）；FBS（1921005PJ，美國Gibco公司）；青霉素和鏈霉素雙抗（10378016，美國Gibco公司）；TrizolReagen（t15596026，美國Invitrogen公司）、實(shí)時熒光定量 PCR混合液（204243，美國Invitrogen公司）；cDNA合成試劑盒購（B532435-0010，上海生工生物有限公司）；抗體ANGPTL2（PA5-44219，美國Invitrogen公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（WB101）、RIPA 細(xì)胞裂解液（北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Tris堿（252859-100G，美國Sigma公司）；甘油（G2289，美國 Sigma公司）；Tween-20（美國 Sigma公司）；NC膜（上海時代生物科技有限公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen公司）；HEPES（15630106，美國 Sigma公司）；質(zhì)粒pSPAX2、pMD2G、shRNA由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室保存；子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞（子宮內(nèi)膜腺癌高分化細(xì)胞）、人腎上皮細(xì)胞系293T細(xì)胞由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室贈送。Nude小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物責(zé)任有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ANGPT2 mRNA表達(dá)檢測 采用實(shí)時熒光定量PCR法。兩組新鮮組織RNA的提取：采用液氮研磨法將組織磨成粉末，加入Trizol混合，按Trizol說明書抽提總RNA。利用在線Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，DNA雙鏈胞嘧啶與胸腺嘧啶核苷酸堿基對含量即GC含量為40%～60% ，產(chǎn)物大小為89～203 bp，再用Oligo 6.0軟件評估。檢測目的基因表達(dá)水平引物均跨內(nèi)含子以減少基因組DNA的干擾，引物序列由上海生工生物工程公司合成。引物：ANGPTL2（162 bp）：上游 5′-GAACCGAGTGCATAAGCAGGA-3′，下游 5′-GTGACCCGCGAGTTCATGTT-3′；GAPDH（101bp）：上游 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′；下游 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。反應(yīng)在25 μl的體系中進(jìn)行，其中2×實(shí)時熒光定量PCR混合液 12.5 μl、10 μmol/L 的上下游引物各 1 μl、樣本cDNA 2 μl（300 ng）、高壓處理過的去離子水8.5 μl。熱循環(huán)如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)；72℃10 min。選擇適宜的基線，各熒光曲線與基線的交叉點(diǎn)即為熒光閾值（Ct）值。應(yīng)用2-ΔΔCt法分析mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.2 ANGPT2蛋白表達(dá)檢測 采用Western blot法。用含有蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液提取標(biāo)本蛋白。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度。用BIO-RAD凝膠電泳系統(tǒng)，取60 μg樣本，置于足量的電泳液中，根據(jù)測得的蛋白濃度上樣，10% SDS-PAGE膠電泳，恒壓100 V，90 min；電泳結(jié)束后，將樣品轉(zhuǎn)移到NC膜，恒壓100 V，90 min。用PBS配置的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后用PBS配置的2% FBS按相應(yīng)濃度稀釋抗體，4℃輕搖孵育過夜。第2天，回收一抗，用TBST（Tween-20與TBS按照1∶1 000的比例配制成）室溫洗膜5 min，洗3次；用PBS配制的2% BSA按照1∶5 000稀釋二抗，NC膜室溫孵育二抗1 h，然后TBST洗膜5min，3次。凝膠圖像采集及分析：用CCD攝像頭，Quantity One凝膠圖像處理系統(tǒng)，分析得出蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 ANGPTL2敲除慢病毒制備 提前24 h準(zhǔn)備1.5×106293T細(xì)胞接種到10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入10 ml DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS）中。將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱24 h后，待細(xì)胞密度大約70%時準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染；將慢病毒包裝質(zhì)粒 pSPAX2 12 μg、pMD2G 4 μg、目的基因敲除 shRNA 質(zhì)粒 16 μg（敲除組）和 pSPAX2 12 μg、pMD2G 4 μg、plKO.1-Scramble 質(zhì)粒 16 μg（對照組）分別加入1.5 ml無菌EP管中，再加入2.5 mol/L氯化鈣 50 μl，并用滅菌水補(bǔ)至 500 μl，吹打混勻；將配置好的混合液逐滴加入500 μl 2×HBS（280 mmol/L氯化鈉，10 mmol/L氯化鉀，1.5 mmol/L磷酸氫二鈉，12 mmol/L葡萄糖，50 mmol/L HEPES），室溫靜置 30 min；將上述混合液緩慢逐滴加入293T細(xì)胞培養(yǎng)液中；4 h后，換液，用10 ml新鮮DMEM培養(yǎng)液（含10% FBS）更換原培養(yǎng)液；48 h后，收取該293T培養(yǎng)液上清液即慢病毒上清液。

1.3.4 ANGPTL2敲除慢病毒感染子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞收集子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞，先按照2 ml/孔，細(xì)胞懸液密度為1×105/ml的標(biāo)準(zhǔn)接種至6孔板，24 h后對其進(jìn)行慢病毒感染，將細(xì)胞培養(yǎng)液吸盡，加入慢病毒上清液，37°C 2 000 r/min離心感染2 h，分為ANGPTL2敲除組和對照組，分別采用實(shí)時熒光定量PCR法和Western blot法檢測細(xì)胞ANGPTL2 mRNA、蛋白表達(dá)水平，方法同上。然后采用流式細(xì)胞儀分選綠色熒光蛋白陽性細(xì)胞，即慢病毒感染陽性細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，繪制細(xì)胞增殖曲線檢測細(xì)胞增殖情況。

1.3.5 小鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 利用構(gòu)建成功的ANGPTL2敲除子宮內(nèi)膜腺癌Ishikawa細(xì)胞（ANGPTL2敲除組和對照組），用1 ml注射器，分別植入20只6～8周齡小鼠左、右背部皮下，細(xì)胞數(shù)量為2×106個，移植6周后處死小鼠取出腫瘤組織，記錄腫瘤體積和重量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜腺癌組織與正常組織ANGPTL2 mRNA、蛋白表達(dá)水平比較 見圖1-2。

圖1 子宮內(nèi)膜腺癌組織與正常組織血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）mRNA表達(dá)水平比較

圖2 子宮內(nèi)膜腺癌組織與正常組織血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）蛋白表達(dá)電泳圖

由圖1可見，子宮內(nèi)膜腺癌組織ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平為子宮內(nèi)膜正常組織的2.64倍；由圖2可見，4組蛋白ANGPTL2條帶灰度掃描結(jié)果為（1.0，1.23，4.82，4.52），子宮內(nèi)膜腺癌組織ANGPTL2蛋白表達(dá)水平為子宮內(nèi)膜正常組織的4.2倍，兩者比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。即ANGPTL2在子宮內(nèi)膜腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。

2.2 ANGPTL2 mRNA、蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系分析 見表1。

由表1可見，ANGPTL2 mRNA表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜腺癌病理分級、臨床分期均有關(guān)（均P＜0.05），與患者絕經(jīng)情況、雌激素受體、孕激素受體、BMI均無關(guān)（均P＞0.05）。ANGPTL2蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜腺癌病理分級有關(guān)（P＜0.05)，與絕經(jīng)情況、臨床分期、雌激素受體、孕激素受體BMI均無關(guān)（均P＜0.05）。

表1 血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）mRNA、蛋白表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 敲除組和對照組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞ANGPTL2 mRNA、蛋白表達(dá)水平和增殖情況比較 見圖3-5。

圖3 敲除組和對照組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）mRNA表達(dá)水平比較

圖4 敲除組和對照組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞血管生成樣蛋白2（ANGPTL2）蛋白表達(dá)電泳圖

由圖3-4可見，與對照組細(xì)胞相比，敲除組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞ANGPTL2 mRNA、蛋白表達(dá)水平均下降（均P＜0.05）。由圖5可見，敲除組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖受抑制，即敲除ANGPTL2可以有效抑制子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞生長。

圖5 敲除組和對照組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖情況比較

2.4 ANGPTL2敲除組與對照組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞皮下成瘤小鼠腫瘤生長情況比較 對照組腫瘤體積（502.93±134.23）mm3，重量（0.71±0.37）g；敲除組腫瘤體積（122.90±39.13）mm3，重量（0.32±0.20）g；兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

子宮內(nèi)膜腺癌是原發(fā)于子宮內(nèi)膜表面或腺上皮的惡性腫瘤。近年來，子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病率有升高的趨勢，在發(fā)達(dá)國家中已成為女性生殖道最常見的惡性腫瘤。目前，子宮內(nèi)膜腺癌的治療以手術(shù)為主，輔以放化療以及孕激素治療[8-10]。隨著人們對子宮內(nèi)膜腺癌研究的深入，逐漸認(rèn)識到子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟、多基因改變的過程。因此嘗試多種治療子宮內(nèi)膜腺癌的潛在途徑和方法，如基因的靶向治療[11]或腫瘤的免疫治療[12]，顯得尤為重要。

現(xiàn)有研究結(jié)果顯示，ANGPTL2在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，如胃癌[5]、肝癌[13]等。Lin等[13]研究結(jié)果提示在肝癌組織中，ANGPTL2明顯高于正常對照組，高ANGPTL2水平與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。劉展等[14]研究結(jié)果提示，胃癌組織中ANGPTL2表達(dá)水平顯著升高，且ANGPTL2表達(dá)水平與腫瘤的病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，并且體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞株中腫瘤細(xì)胞惡性程度越高，ANGPTL2表達(dá)越強(qiáng)。本研究結(jié)果顯示，與正常子宮內(nèi)膜組織相比，子宮內(nèi)膜腺癌組織中ANGPTL2的表達(dá)水平，無論是mRNA水平還是蛋白水平，均顯著增高，并且ANGPTL2與腫瘤的分化情況、病理分級密切相關(guān)。這提示，ANGPTL2與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展甚至預(yù)后緊密相關(guān)。這與現(xiàn)有報(bào)道結(jié)果也是相符的。

ANGPTL2表達(dá)可調(diào)控腫瘤細(xì)胞多條重要通路，且與患者預(yù)后密切相關(guān)。研究表明ANGPTL2可通過NF-κB/AKT/mTOR信號通路調(diào)控腫瘤微環(huán)境中破骨細(xì)胞再生過程，促進(jìn)骨質(zhì)流式過程[15]。而在造血干細(xì)胞中ANGPTL2通過與其配體結(jié)合，促進(jìn)造血干細(xì)胞的擴(kuò)增，自我更新及干性維持過程[16]；ANGPTL2同時也參與了免疫系統(tǒng)相關(guān)的免疫過程，如巨噬細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的激活過程[17]；而腫瘤組織中，ANGPTL2起到了各種不同的作用，在胃癌組織中，高表達(dá)ANGPTL2可促進(jìn)腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移過程[5]；而在肺癌中，ANGPTL2通過CREB/CAMK1/SHP2信號通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖過程[18]，另一方面，ANGPTL2表達(dá)促進(jìn)非小細(xì)胞性肺癌細(xì)胞淋巴結(jié)侵襲過程[19]。因此，ANGPTL2在機(jī)體正常環(huán)境中與在腫瘤微環(huán)境過程中呈現(xiàn)完全不同的功能，且其具體調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。因此，本研究探討了子宮內(nèi)膜腺癌實(shí)體腫瘤與子宮內(nèi)膜正常組織中ANGPTL2的表達(dá)水平是否存在差異，以及其在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖與侵襲中所發(fā)揮的作用，以期為治療子宮內(nèi)膜腺癌提供新的靶點(diǎn)。

本研究在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中敲除ANGPTL2表達(dá)，結(jié)果顯示敲除組子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖能力受到顯著抑制。體內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)顯示ANGPTL2表達(dá)的減少，可使子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞在Nude鼠體內(nèi)的增殖能力顯著減弱，ANGPTL2敲除組子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞具有較低的成瘤能力。本研究結(jié)果表明ANGPTL2有助于子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞增殖。抑制ANGPTL2表達(dá)可在一定程度上緩解子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞惡性增殖能力，聯(lián)合現(xiàn)有的臨床治療，或能改善患者預(yù)后。