基于生物信息學的胃腸道間質瘤低級至高級轉變的潛在關鍵基因與信號通路研究

吳江山，黃興蔚，曾毅飛，莫蘭梅，方青華，韋珍平

（廣西醫科大學附屬武鳴醫院 消化內科，廣西 南寧 530000）

0 引言

胃腸道間質瘤(GISTs)指原發于胃腸道、大網膜和腸系膜的c-KIT(CD117，干細胞因子受體)染色陽性的梭形細胞或上皮樣細胞的一組間葉源性腫瘤，其最常發生在胃，發病率為60%～70%，為胃間質瘤[1]。GISTs 的大體病理表現為腫瘤直徑2～20cm不等，境界清楚質硬腫塊，切面呈灰白色或紅棕色，囊性或實性，也可伴有壞死及黏液變性；其常見臨床癥狀有惡心、嘔吐、上腹痛、貧血、腫塊與上胃腸道出血等。GISTs 是一種交界性腫瘤，國內外常用的風險評估標準有Fletcher 分級標準、AFIP 分級標準和改良的NIH 分級標準;而后，Fletcher 等人[2]在2002 年提出用極低危險度、低危險度、中危險度及高危險度取代良惡性劃分，這一分級標準得到學術界廣泛的認可。

眾所周知，GISTs 的臨床表現多樣，其非特異的臨床表現給臨床診斷及治療帶來了困難[3]。因此，目前對GISTs 的防治及基礎研究仍然刻不容緩。GISTs 的發生、發展是個復雜的生物學過程，目前一般認為GISTs 的發生是沿著“低度惡性原發病灶-高度惡性原發病灶-轉移病灶”方向發展與惡化。而這一過程涉及到多基因、多通路，并伴隨復雜的分子機制的過程[4]。因此探討“GISTs 惡化”的關鍵基因及信號通路，對阻斷GISTs 由低度惡性向高度惡性轉化具有重要意義。

此外，近年來，隨著基因工程技術的完善和高通量測序技術的廣泛應用[5-6]，臨床中積累了大量GISTs 基因表達譜數據，這為全面探究GISTs 發病及惡化機制的分子生物學機制研究創造了條件。為了闡明GISTs 惡化過程中的潛在關鍵分子及生物學過程，本文利用公共基因芯數據庫GEO 中的芯片數據，對惡性GIST（轉移性和高危GIST）和惡性程度較低的GIST（低和極低風險GIST）的相關基因進行生物信息學分析，挖掘出與GISTs 惡化過程相關的潛在關鍵基因及信號通路，并構建了這些基因編碼蛋白的蛋白互作網絡，找出其中關鍵蛋白，以揭示GISTs惡化的發病機制。同時為改善GIST 預后、阻斷“GIST惡性轉變”的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因表達譜芯片

利用 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 平臺下 的 GEO（GENE EXPRESSION OMNIBUS）數據庫，檢索GIST 的相關基因數據，在檢索結果中選擇 GSE136755[7]數據進行挖掘。GSE136755 是由日本學者使用agilent sureprint g3 人類基因表達8×60k v2 微陣列測定65 個GIST的mrna 表達譜。其中，包括6 個轉移瘤和59 個原發瘤（胃、小腸、直腸和食道）。同時，GIST 的惡性程度如表1。

1.2 數據處理及差異基因分析

下載研究所需的GSE136755 數據[8]，然后對數據進行整理及優化。將探針轉化為標準基因名稱，對具有相同基因名的表達水平取平均水平。隨后將數據分為高惡化組（17 例）和低惡化組（33 例），利用 R 語言的 Limma 軟件包進行差異基因篩選。選取adj.PValue＜0.05、|logFC |＞1 的基因作為候選差異基因。

1.3 GO 富集和 KEGG 通路富集

為了闡明這些差異基因在GISTs 惡化過程中所發揮的作用，我們采用clusterprofile 包對基因GO 和KEGG 信號通路富集分析。根據 adjusted P-value＜0.05 進行GISTs 惡化過程差異基因相關GO 條目及通路的篩選，進而從生物過程及信號通路程角度分析這些差異基因在GISTs 惡化過程中可能發揮的分子生物學作用。

1.4 PPI 網絡聯合轉錄因子預測

為了從差異基因所表達的蛋白層面說明這些蛋白之間的相互作用關系，將差異基因所對應的蛋白上傳至STRING 數據庫，本研究選取的是打分值高于0.4 的最高置信度的數據，構建由導入基因所表達產物組成的PPI 網絡，并且利用Cytoscape 軟件將蛋白相互作用網絡圖可視化。同時，我們使用iRegulon 軟件對PPI 網絡內的基因進行轉錄因子富集預測，NES 排名前6 的轉錄因子被可視化。

1.5 關鍵基因的篩選

為了進一步篩選與GISTs 惡化過程相關的潛在關鍵基因，我們使用cytoHubba 插件里面的11 中算法對PPI 網絡進行重要模塊分析。最后選擇Degree前10 的基因作為與GISTs 惡化過程相關的潛在關鍵基因。

2 結果

2.1 數據預處理及差異分析

從GEO 數據庫下載的GSE136755 數據經預處理后（如圖1 所示，A 是預處理前的數據表達情況，B是處理后的基因表達情況，可知經數據處理后基因的表達處于均一化），我們得到18652 個基因的表達矩陣（圖1C）。經過差異分析后，753 個差異基因被篩選出來，其中378 個差異基因在GIST 高惡化組是上調的，而375 個基因在GIST 高惡化組是下調的 （adj.PValue＜0.05、|logFC |＞1）。分別選擇這些差異基因中上下調最明顯的100 個基因作熱圖展示（圖1D，50 個上調基因和50 個下調基因）。

2.2 富集分析

本研究進行了差異基因的富集分析。753 個差異基因的GO 生物過程功能主要富集在免疫方面，如MHC II 類受體活性，抗原結合和受體調節活性等（圖1E，adjusted P-value＜0.05）。而KEGG 信號通路富集分析結果顯示，這些差異基因主要富集在多種信號通路和免疫功能方面，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、產生IgA 的腸道免疫網絡、Th17 細胞分化和抗原處理等（圖1F，adjusted P-value＜0.05）。

2.3 PPI 和轉錄因子預測網絡

通過STRING 11.0 在線網絡工具對753 個差異基因進行蛋白質相互作用網絡分析，排除其中無相互作用的蛋白，最后得到由 635 個節點（其余118 個基因，相互之間無關聯網絡）、7036 條連接構成的蛋白質相互作用網絡圖。此外，我們還通過iRegulon 插件對這些PPI 網絡里面的基因進行了轉錄因子預測，最后構建了PPI 和轉錄因子預測網絡（圖2A）。6個轉錄因子被預測出來，包括IRF1、SIN3A、E2F4、TFDP1、FOXM1 和MYBL2，圖中的蛋白與其他節點連線越多，表明該蛋白在該網絡中越重要。

2.4 潛在關鍵基因篩選

在本研究中，我們最后通過cytoHubba 插件里面的11 種方法篩選PPI 網絡中的重要模塊，篩選出可能與GISTs 惡化過程相關的潛在關鍵基因。其結果顯示在這11 種方法里面沒有共同的交集基因。同時，目前較為準確的預測方法為Degree。因此，我們最后通過Degree 排名確定了前10（＞100）的10 個關鍵基因，分別是KIF11、CDK1、AURKA、CCNB1、KIF15、CCNA2、BUB1、KIF4A、KIF2C 和KIF20A（圖2C）。

3 討論

在本研究中，我們使用綜合的生物信息學方法挖掘了GSE136755 這一芯片數據，篩選出753 個差異差異基因。同時，我們進一步通過各種在線軟件及R 語言軟件分析了可能與GIST 惡化這一分子生物學過程相關的潛在關鍵基因和信號通路。結果我們發現這些差異基因的GO term 主要富集在免疫方面，如MHC II 類受體活性，抗原結合和受體調節活性等；其信號通路富集主要體現在多種信號通路和免疫功能方面，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、Th1 和Th2 細胞分化、產生IgA 的腸道免疫網絡、Th17 細胞分化和抗原處理等。同時，KIF11、CDK1、AURKA、CCNB1、KIF15、CCNA2、BUB1、KIF4A、KIF2C 和KIF20A 可視為“GIST 惡化”過程的關鍵基因。因此，我們就以上結果簡要作以下分析。

首先，從與GIST 惡化過程相關的生物學過程及信號通路上分析。眾所周知，腫瘤的發生發展涉及到許多的生物學過程及信號通路，如細胞增殖、細胞分化、Hippo 通路[9]、Wnt 通路[10]、免疫反應[11]等。而本研究結合大數據分析發現GIST 的惡化過程主要與免疫學機制相關。當腫瘤發生時，機制產生免疫反應對腫瘤細胞進行抵抗，包括固有免疫和適應性免疫。同時，當機制的免疫調節機制發生變化時，腫瘤細胞也會發生一定的反應[12]。同時，免疫學機制在各種生物學過程中的研究已收到越來越多的關注，但其在GIST 的惡化過程的研究還較少，故免疫機制在GIST 惡化過程中的研究仍有廣泛前景。

其次，從與GIST 惡化過程相關的潛在關鍵基因來 說。KIF11[13]（kinesin family member 11） 是驅動蛋白家族成員。眾所周知，這種蛋白質家族的成員參與各種紡錘體動力學，該基因產物的功能包括染色體定位、中心體分離和在細胞有絲分裂期間建立雙極紡錘體。這種紡錘絲中心體的分裂可促進細胞分裂，而GIST 惡化是一種腫瘤細胞不斷增殖的過程，因而KIF11 是否可通過中心體機制調控GIST腫瘤細胞增殖有待進一步研究。CDK1[14]（cyclin dependent kinase 1）是一種細胞周期蛋白，其編碼的蛋白質是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員；這種蛋白是高度保守的蛋白激酶復合體的催化亞單位，被稱為M 相促進因子(MPF)，它在真核細胞周期的G1/S 和G2/M 相轉變過程中發揮著重要作用[15]。同時，CDK1 的激酶活性受細胞周期蛋白在細胞周期中積累和破壞的調控，其磷酸化和去磷酸化過程在細胞周期控制中也起著重要的調節作用。AURKA[16]（aurora kinase A）編碼的蛋白質是一種細胞周期調節激酶，在染色體分離過程中參與微管的形成和紡錘體桿的穩定。已有大量的研究表明，AURKA 可能在腫瘤的發展和進程中發揮作用，但其在GIST 惡化過程中發揮的機制有待進一步探索。眾所周知，CCNB1（cyclin B1）編碼的蛋白質是參與有絲分裂的調節蛋白，其基因產物與p34(cdc2)復合形成促成熟因子(MPF)；同時調控著細胞周期G2/M 的轉換。而KIF15（kinesin family member 15）目前來說研究的還較少[17]。CCNA2[18]（CCNA2 cyclin A2）編碼的蛋白質屬于高度保守的細胞周期蛋白家族，其可結合并激活細胞周期蛋白依賴激酶2，從而促進通過G1 和G2 的轉化。BUB1（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase）該基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在有絲分裂中起核心作用。其編碼蛋白的部分功能是通過磷酸化有絲分裂檢查點復合體的成員和激活紡錘體檢查點而發揮作用。已有研究表明，BUB1 的突變與非整倍性和幾種癌癥有關，但尚未見有關BUB1 與GIST 惡化相關的報道。KIF4A[19]（kinesin family member 4A）編碼的蛋白是一種依賴三磷酸腺苷的微管基運動蛋白，可參與膜性細胞器的細胞內運輸；這種蛋白質也與濃縮的染色體臂相關聯，并可能在有絲分裂期間參與維持染色體完整性。目前研究較多的是KIF4A 可能在胞質分裂前參與中樞神經的組織。KIF2C[20]（kinesin family member 2C）編碼一種驅動蛋白樣蛋白，起微管依賴分子馬達的作用；其主要在正端解聚微管，從而促進有絲分裂染色體的分離。而KIF20A[1]（kinesin family member 20A）基因目前研究的還較少。值得注意的是，我們通過數據挖掘所得到的這些基因發揮的作用（有絲分裂及細胞周期的變化）與我們預測的信號通路（細胞的增殖、分化）息息相關；但其是否在GIST 惡化過程中也發揮著重要作用有待進一步的體內外實驗驗證。

圖1

總而言之，本研究通過對GEO 數據庫中的關于惡性GIST（轉移性和高危GIST）和惡性程度較低的GIST（低和極低風險GIST）的相關數據進行挖掘，發現GIST 惡化過程中潛在的關鍵基因與通路。通過對這些關鍵基因與通路進行分析，發現他們在腫瘤形成當中可能發揮的作用，可為今后進一步開展實驗研究，探索GIST 的發生、發展及抗腫瘤藥物的研制提供思路和依據。同時，從治療及患者手術預后角度而言，運用手術及基因靶向治療的多種機制相契合，運用系統生物學方法可更好地探索GIST 的惡化，通過信息學手段全面地構建通路網絡，可以為后續GIST 的惡化過程干預機制研究提供潛在的思路。

圖2