基于生物信息學(xué)的胃腸道間質(zhì)瘤低級至高級轉(zhuǎn)變的潛在關(guān)鍵基因與信號通路研究

吳江山，黃興蔚，曾毅飛，莫蘭梅，方青華，韋珍平

（廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院 消化內(nèi)科，廣西 南寧 530000）

0 引言

胃腸道間質(zhì)瘤(GISTs)指原發(fā)于胃腸道、大網(wǎng)膜和腸系膜的c-KIT(CD117，干細(xì)胞因子受體)染色陽性的梭形細(xì)胞或上皮樣細(xì)胞的一組間葉源性腫瘤，其最常發(fā)生在胃，發(fā)病率為60%～70%，為胃間質(zhì)瘤[1]。GISTs 的大體病理表現(xiàn)為腫瘤直徑2～20cm不等，境界清楚質(zhì)硬腫塊，切面呈灰白色或紅棕色，囊性或?qū)嵭裕部砂橛袎乃兰梆ひ鹤冃裕黄涑Ｒ娕R床癥狀有惡心、嘔吐、上腹痛、貧血、腫塊與上胃腸道出血等。GISTs 是一種交界性腫瘤，國內(nèi)外常用的風(fēng)險評估標(biāo)準(zhǔn)有Fletcher 分級標(biāo)準(zhǔn)、AFIP 分級標(biāo)準(zhǔn)和改良的NIH 分級標(biāo)準(zhǔn);而后，F(xiàn)letcher 等人[2]在2002 年提出用極低危險度、低危險度、中危險度及高危險度取代良惡性劃分，這一分級標(biāo)準(zhǔn)得到學(xué)術(shù)界廣泛的認(rèn)可。

眾所周知，GISTs 的臨床表現(xiàn)多樣，其非特異的臨床表現(xiàn)給臨床診斷及治療帶來了困難[3]。因此，目前對GISTs 的防治及基礎(chǔ)研究仍然刻不容緩。GISTs 的發(fā)生、發(fā)展是個復(fù)雜的生物學(xué)過程，目前一般認(rèn)為GISTs 的發(fā)生是沿著“低度惡性原發(fā)病灶-高度惡性原發(fā)病灶-轉(zhuǎn)移病灶”方向發(fā)展與惡化。而這一過程涉及到多基因、多通路，并伴隨復(fù)雜的分子機制的過程[4]。因此探討“GISTs 惡化”的關(guān)鍵基因及信號通路，對阻斷GISTs 由低度惡性向高度惡性轉(zhuǎn)化具有重要意義。

此外，近年來，隨著基因工程技術(shù)的完善和高通量測序技術(shù)的廣泛應(yīng)用[5-6]，臨床中積累了大量GISTs 基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，這為全面探究GISTs 發(fā)病及惡化機制的分子生物學(xué)機制研究創(chuàng)造了條件。為了闡明GISTs 惡化過程中的潛在關(guān)鍵分子及生物學(xué)過程，本文利用公共基因芯數(shù)據(jù)庫GEO 中的芯片數(shù)據(jù)，對惡性GIST（轉(zhuǎn)移性和高危GIST）和惡性程度較低的GIST（低和極低風(fēng)險GIST）的相關(guān)基因進行生物信息學(xué)分析，挖掘出與GISTs 惡化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因及信號通路，并構(gòu)建了這些基因編碼蛋白的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，找出其中關(guān)鍵蛋白，以揭示GISTs惡化的發(fā)病機制。同時為改善GIST 預(yù)后、阻斷“GIST惡性轉(zhuǎn)變”的研究提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 基因表達(dá)譜芯片

利用 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 平臺下 的 GEO（GENE EXPRESSION OMNIBUS）數(shù)據(jù)庫，檢索GIST 的相關(guān)基因數(shù)據(jù)，在檢索結(jié)果中選擇 GSE136755[7]數(shù)據(jù)進行挖掘。GSE136755 是由日本學(xué)者使用agilent sureprint g3 人類基因表達(dá)8×60k v2 微陣列測定65 個GIST的mrna 表達(dá)譜。其中，包括6 個轉(zhuǎn)移瘤和59 個原發(fā)瘤（胃、小腸、直腸和食道）。同時，GIST 的惡性程度如表1。

1.2 數(shù)據(jù)處理及差異基因分析

下載研究所需的GSE136755 數(shù)據(jù)[8]，然后對數(shù)據(jù)進行整理及優(yōu)化。將探針轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)基因名稱，對具有相同基因名的表達(dá)水平取平均水平。隨后將數(shù)據(jù)分為高惡化組（17 例）和低惡化組（33 例），利用 R 語言的 Limma 軟件包進行差異基因篩選。選取adj.PValue＜0.05、|logFC |＞1 的基因作為候選差異基因。

1.3 GO 富集和 KEGG 通路富集

為了闡明這些差異基因在GISTs 惡化過程中所發(fā)揮的作用，我們采用clusterprofile 包對基因GO 和KEGG 信號通路富集分析。根據(jù) adjusted P-value＜0.05 進行GISTs 惡化過程差異基因相關(guān)GO 條目及通路的篩選，進而從生物過程及信號通路程角度分析這些差異基因在GISTs 惡化過程中可能發(fā)揮的分子生物學(xué)作用。

1.4 PPI 網(wǎng)絡(luò)聯(lián)合轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測

為了從差異基因所表達(dá)的蛋白層面說明這些蛋白之間的相互作用關(guān)系，將差異基因所對應(yīng)的蛋白上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫，本研究選取的是打分值高于0.4 的最高置信度的數(shù)據(jù)，構(gòu)建由導(dǎo)入基因所表達(dá)產(chǎn)物組成的PPI 網(wǎng)絡(luò)，并且利用Cytoscape 軟件將蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖可視化。同時，我們使用iRegulon 軟件對PPI 網(wǎng)絡(luò)內(nèi)的基因進行轉(zhuǎn)錄因子富集預(yù)測，NES 排名前6 的轉(zhuǎn)錄因子被可視化。

1.5 關(guān)鍵基因的篩選

為了進一步篩選與GISTs 惡化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因，我們使用cytoHubba 插件里面的11 中算法對PPI 網(wǎng)絡(luò)進行重要模塊分析。最后選擇Degree前10 的基因作為與GISTs 惡化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理及差異分析

從GEO 數(shù)據(jù)庫下載的GSE136755 數(shù)據(jù)經(jīng)預(yù)處理后（如圖1 所示，A 是預(yù)處理前的數(shù)據(jù)表達(dá)情況，B是處理后的基因表達(dá)情況，可知經(jīng)數(shù)據(jù)處理后基因的表達(dá)處于均一化），我們得到18652 個基因的表達(dá)矩陣（圖1C）。經(jīng)過差異分析后，753 個差異基因被篩選出來，其中378 個差異基因在GIST 高惡化組是上調(diào)的，而375 個基因在GIST 高惡化組是下調(diào)的 （adj.PValue＜0.05、|logFC |＞1）。分別選擇這些差異基因中上下調(diào)最明顯的100 個基因作熱圖展示（圖1D，50 個上調(diào)基因和50 個下調(diào)基因）。

2.2 富集分析

本研究進行了差異基因的富集分析。753 個差異基因的GO 生物過程功能主要富集在免疫方面，如MHC II 類受體活性，抗原結(jié)合和受體調(diào)節(jié)活性等（圖1E，adjusted P-value＜0.05）。而KEGG 信號通路富集分析結(jié)果顯示，這些差異基因主要富集在多種信號通路和免疫功能方面，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th17 細(xì)胞分化和抗原處理等（圖1F，adjusted P-value＜0.05）。

2.3 PPI 和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)絡(luò)

通過STRING 11.0 在線網(wǎng)絡(luò)工具對753 個差異基因進行蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析，排除其中無相互作用的蛋白，最后得到由 635 個節(jié)點（其余118 個基因，相互之間無關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)）、7036 條連接構(gòu)成的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。此外，我們還通過iRegulon 插件對這些PPI 網(wǎng)絡(luò)里面的基因進行了轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測，最后構(gòu)建了PPI 和轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測網(wǎng)絡(luò)（圖2A）。6個轉(zhuǎn)錄因子被預(yù)測出來，包括IRF1、SIN3A、E2F4、TFDP1、FOXM1 和MYBL2，圖中的蛋白與其他節(jié)點連線越多，表明該蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中越重要。

2.4 潛在關(guān)鍵基因篩選

在本研究中，我們最后通過cytoHubba 插件里面的11 種方法篩選PPI 網(wǎng)絡(luò)中的重要模塊，篩選出可能與GISTs 惡化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因。其結(jié)果顯示在這11 種方法里面沒有共同的交集基因。同時，目前較為準(zhǔn)確的預(yù)測方法為Degree。因此，我們最后通過Degree 排名確定了前10（＞100）的10 個關(guān)鍵基因，分別是KIF11、CDK1、AURKA、CCNB1、KIF15、CCNA2、BUB1、KIF4A、KIF2C 和KIF20A（圖2C）。

3 討論

在本研究中，我們使用綜合的生物信息學(xué)方法挖掘了GSE136755 這一芯片數(shù)據(jù)，篩選出753 個差異差異基因。同時，我們進一步通過各種在線軟件及R 語言軟件分析了可能與GIST 惡化這一分子生物學(xué)過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因和信號通路。結(jié)果我們發(fā)現(xiàn)這些差異基因的GO term 主要富集在免疫方面，如MHC II 類受體活性，抗原結(jié)合和受體調(diào)節(jié)活性等；其信號通路富集主要體現(xiàn)在多種信號通路和免疫功能方面，如PI3K-Akt 信號通路、p53 信號通路、Th1 和Th2 細(xì)胞分化、產(chǎn)生IgA 的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、Th17 細(xì)胞分化和抗原處理等。同時，KIF11、CDK1、AURKA、CCNB1、KIF15、CCNA2、BUB1、KIF4A、KIF2C 和KIF20A 可視為“GIST 惡化”過程的關(guān)鍵基因。因此，我們就以上結(jié)果簡要作以下分析。

首先，從與GIST 惡化過程相關(guān)的生物學(xué)過程及信號通路上分析。眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及到許多的生物學(xué)過程及信號通路，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、Hippo 通路[9]、Wnt 通路[10]、免疫反應(yīng)[11]等。而本研究結(jié)合大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)GIST 的惡化過程主要與免疫學(xué)機制相關(guān)。當(dāng)腫瘤發(fā)生時，機制產(chǎn)生免疫反應(yīng)對腫瘤細(xì)胞進行抵抗，包括固有免疫和適應(yīng)性免疫。同時，當(dāng)機制的免疫調(diào)節(jié)機制發(fā)生變化時，腫瘤細(xì)胞也會發(fā)生一定的反應(yīng)[12]。同時，免疫學(xué)機制在各種生物學(xué)過程中的研究已收到越來越多的關(guān)注，但其在GIST 的惡化過程的研究還較少，故免疫機制在GIST 惡化過程中的研究仍有廣泛前景。

其次，從與GIST 惡化過程相關(guān)的潛在關(guān)鍵基因來 說。KIF11[13]（kinesin family member 11） 是驅(qū)動蛋白家族成員。眾所周知，這種蛋白質(zhì)家族的成員參與各種紡錘體動力學(xué)，該基因產(chǎn)物的功能包括染色體定位、中心體分離和在細(xì)胞有絲分裂期間建立雙極紡錘體。這種紡錘絲中心體的分裂可促進細(xì)胞分裂，而GIST 惡化是一種腫瘤細(xì)胞不斷增殖的過程，因而KIF11 是否可通過中心體機制調(diào)控GIST腫瘤細(xì)胞增殖有待進一步研究。CDK1[14]（cyclin dependent kinase 1）是一種細(xì)胞周期蛋白，其編碼的蛋白質(zhì)是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員；這種蛋白是高度保守的蛋白激酶復(fù)合體的催化亞單位，被稱為M 相促進因子(MPF)，它在真核細(xì)胞周期的G1/S 和G2/M 相轉(zhuǎn)變過程中發(fā)揮著重要作用[15]。同時，CDK1 的激酶活性受細(xì)胞周期蛋白在細(xì)胞周期中積累和破壞的調(diào)控，其磷酸化和去磷酸化過程在細(xì)胞周期控制中也起著重要的調(diào)節(jié)作用。AURKA[16]（aurora kinase A）編碼的蛋白質(zhì)是一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶，在染色體分離過程中參與微管的形成和紡錘體桿的穩(wěn)定。已有大量的研究表明，AURKA 可能在腫瘤的發(fā)展和進程中發(fā)揮作用，但其在GIST 惡化過程中發(fā)揮的機制有待進一步探索。眾所周知，CCNB1（cyclin B1）編碼的蛋白質(zhì)是參與有絲分裂的調(diào)節(jié)蛋白，其基因產(chǎn)物與p34(cdc2)復(fù)合形成促成熟因子(MPF)；同時調(diào)控著細(xì)胞周期G2/M 的轉(zhuǎn)換。而KIF15（kinesin family member 15）目前來說研究的還較少[17]。CCNA2[18]（CCNA2 cyclin A2）編碼的蛋白質(zhì)屬于高度保守的細(xì)胞周期蛋白家族，其可結(jié)合并激活細(xì)胞周期蛋白依賴激酶2，從而促進通過G1 和G2 的轉(zhuǎn)化。BUB1（BUB1 mitotic checkpoint serine/threonine kinase）該基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在有絲分裂中起核心作用。其編碼蛋白的部分功能是通過磷酸化有絲分裂檢查點復(fù)合體的成員和激活紡錘體檢查點而發(fā)揮作用。已有研究表明，BUB1 的突變與非整倍性和幾種癌癥有關(guān)，但尚未見有關(guān)BUB1 與GIST 惡化相關(guān)的報道。KIF4A[19]（kinesin family member 4A）編碼的蛋白是一種依賴三磷酸腺苷的微管基運動蛋白，可參與膜性細(xì)胞器的細(xì)胞內(nèi)運輸；這種蛋白質(zhì)也與濃縮的染色體臂相關(guān)聯(lián)，并可能在有絲分裂期間參與維持染色體完整性。目前研究較多的是KIF4A 可能在胞質(zhì)分裂前參與中樞神經(jīng)的組織。KIF2C[20]（kinesin family member 2C）編碼一種驅(qū)動蛋白樣蛋白，起微管依賴分子馬達(dá)的作用；其主要在正端解聚微管，從而促進有絲分裂染色體的分離。而KIF20A[1]（kinesin family member 20A）基因目前研究的還較少。值得注意的是，我們通過數(shù)據(jù)挖掘所得到的這些基因發(fā)揮的作用（有絲分裂及細(xì)胞周期的變化）與我們預(yù)測的信號通路（細(xì)胞的增殖、分化）息息相關(guān)；但其是否在GIST 惡化過程中也發(fā)揮著重要作用有待進一步的體內(nèi)外實驗驗證。

圖1

總而言之，本研究通過對GEO 數(shù)據(jù)庫中的關(guān)于惡性GIST（轉(zhuǎn)移性和高危GIST）和惡性程度較低的GIST（低和極低風(fēng)險GIST）的相關(guān)數(shù)據(jù)進行挖掘，發(fā)現(xiàn)GIST 惡化過程中潛在的關(guān)鍵基因與通路。通過對這些關(guān)鍵基因與通路進行分析，發(fā)現(xiàn)他們在腫瘤形成當(dāng)中可能發(fā)揮的作用，可為今后進一步開展實驗研究，探索GIST 的發(fā)生、發(fā)展及抗腫瘤藥物的研制提供思路和依據(jù)。同時，從治療及患者手術(shù)預(yù)后角度而言，運用手術(shù)及基因靶向治療的多種機制相契合，運用系統(tǒng)生物學(xué)方法可更好地探索GIST 的惡化，通過信息學(xué)手段全面地構(gòu)建通路網(wǎng)絡(luò)，可以為后續(xù)GIST 的惡化過程干預(yù)機制研究提供潛在的思路。

圖2