眼針治療卒中的臨床療效及Keap1-Nrf2/ARE信號通路與細胞氧化應激反應相關性研究

趙悅,張威,崔宇,尹慧絲

(1.遼寧中醫藥大學附屬醫院,沈陽 110032;2.北部戰區綜藝與北陵分院,沈陽 110000;3.遼寧大學醫院,沈陽 110000)

卒中包括腦梗死、腦出血等,屬于急性腦血管病,并且具有較高的致死致殘率,以局灶性神經功能受損為主要特點,其中卒中后多合并肢體運動功能障礙,發病率較高,患者生活質量明顯下降。肢體活動障礙多表現為肢體平衡能力及控制運動能力下降、肌張力減退、肢體痙攣。其中80%～90%患者會出現不同程度的肢體痙攣[1]。肢體痙攣若得不到有效控制會明顯影響預后。因此進行早期康復治療可有效改善肢體活動平衡能力,降低并發癥出現。該病引起的腦組織損傷發病機制有多種因素參與,如腦組織氧化應激損傷、興奮性氨基酸性中毒、炎癥反應、異常能量代謝等,其中Keap1-Nrf2/ARE氧化應激通路對維持卒中后細胞內氧化還原的平衡狀態有重要影響,該信號通路對下游因子如谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)進行調控,可起到抗細胞凋亡、抗炎癥反應損傷、降低鈣離子超載、抗氧化應激的作用[2]。臨床中眼針療法得到廣泛應用,因其具有操作簡便、療效突出等特點,可明顯緩解肌肉痙攣。NMES可通過對肢體外周運動神經進行低頻電流刺激,促進肢體神經恢復正常電刺激閾值,促進肢體恢復運動控制能力較好[3],本研究采用眼針聯合肌肉神經電刺激(NMES)方法治療卒中后肢體痙攣,探究眼針治療過程中 Keap1-Nrf2/ARE氧化應激通路的抗氧化應激損傷的病理機制,為臨床治療卒中抗氧化應激作用提供理論依據。

1 臨床資料

1.1 一般資料

收集2016年8月至2018年12月遼寧中醫藥大學附屬醫院康復科的80例卒中后肢體痙攣患者,隨機分為兩組(每組 40例),將患者從 1～80進行編號,應用Excel的隨機數字發生器產生隨機數并對隨機數進行排序,排序后的隨機數對研究對象進行分組。觀察組中男23例,女17例;年齡48～64歲,平均(54±6)歲;病程 15～35 d,平均(19.21±4.32)d;肌張力Ⅰ級6例,Ⅰ+級9例,Ⅱ級7例,Ⅲ級8例,Ⅳ級10例。對照組中男25例,女15例;年齡45～65歲,平均(55±8)歲;病程 16～29 d,平均(18.27±5.38)d;肌張力Ⅰ級4例,Ⅰ+級6例,Ⅱ級7例,Ⅲ級12例,Ⅳ級11例。兩組患者的基礎資料比較差異無統計學意義(P＞0.05),具有可比性。本研究得到遼寧中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審核(倫理批件號1709021)。

1.2 診斷標準

西醫診斷標準參考《中國重癥腦血管病管理共識2015》[4]中相關標準;中醫診斷標準參考《中醫病證診斷療效標準》[5](中華人民共和國中醫藥行業標準ZY/T001.1-94)中相關標準。

1.3 納入標準

①滿足上述中醫、西醫相關卒中診斷標準;②頭顱MRI、CT明確診斷;③Brunnstrom分期處于Ⅱ～Ⅳ期;④伴有肌張力增高、肢體痙攣癥狀;⑤年齡40～65歲,病程＜3個月;⑥患者未服用肌松劑、鎮靜藥;⑦改良Ashworth評定結果,患肢肌張力0級以上;⑧家屬簽署知情同意書。

1.4 排除標準

①非卒中引起的神經功能缺失;②肢體運動障礙因關節病變引起;③TIA發作;④神經功能受損可逆;⑤服用肌松劑、鎮靜藥;⑥處于哺乳或妊娠期女性患者;⑦伴有肝腎及其他系統嚴重功能障礙;⑧患有精神疾病,神志異常。

2 治療方法

2.1 基礎治療

兩組均進行常規對癥、支持治療并給予康復訓練(參考Bobath技術)[6]。

2.2 對照組

予NMES治療。應用KX-90A型神經肌肉電刺激儀(北京耀洋康達醫療儀器有限公司)[京藥監械(準)字2009第 2260204號,批號 20090310],輸出電流峰值,在500Ω負載下輸出l P均≤50 mA。軀體電流＜10 mA,頭部電流＜7.5 mA。時間設置為 10 min,緩慢調節電流提高至患者可耐受程度,一般以3～5 mA為適宜電流大小,最大電流≤7 mA。每日電刺激治療1次,每次持續15 min,共治療20 d。

2.3 觀察組

在對照組治療基礎上聯合眼針治療。眼針取穴參考《中華眼針》[7],取雙側上焦區、下焦區、肝區、腎區,具體見圖 1。對施針區域皮膚進行常規消毒,使用0.30 mm×15 mm華佗牌不銹鋼針灸針,于眼瞼處距離眼眶內緣2 mm相應針灸穴區進行橫刺,從一側穴區刺入,斜向另一側穴區,刺入皮下,維持針體留在穴區內。對眼眶內緣穴區用押手拇指輕輕扶起,進針深度保持在(12±2)mm,進針要求快、準、穩,患者感到脹痛為適宜,不施以任何手法操作,留針時間30 min。予以眼針治療后,囑患者帶針在室內進行平地步行,或在家屬攙扶下在病房走廊緩慢步行,每次步行時間約為 10～20 min,不疲勞為適宜。家屬應站在患側,防止跌倒。每日治療1次,共治療20 d。

圖1 眼穴位置

3 治療效果

3.1 觀察指標

3.1.1 PBMC中Keap1、Nrf2、ARE分子表達水平

應用Western blot檢測,分別于治療前后采集患者清晨空腹外周靜脈血 5 mL,予以肝素抗凝,應用Ficoll淋巴細胞分離液在2 h內完成外周血淋巴細胞的無菌分離,于1640培養液內進行2次洗滌,再經過重懸后可收集到PBMC[8],將PBMC加入到配制的細胞裂解液中進行裂解,4℃、12000 r/min離心15 min,收集離心后上清液,獲得總蛋白,根據BCA法對蛋白濃度進行配平及測定。均取30 μL樣品進行SDS-PAGE電泳,使用分離膠120 V、濃縮膠80 V,采用電轉移法將相應蛋白轉移至PVDF膜上,室溫封閉2 h(使用5%脫脂牛奶封閉液),封閉后進行 4℃孵育過夜,加入特異性一抗,第二天使用TBST進行10 min洗滌,共洗滌3次,孵育二抗經熒光標記的羊抗兔二抗(1:10000)1 h后洗膜,再次使用TBST進行洗滌(同前),采用ECL發光顯影。應用 QuantityOne軟件對灰度值進行測定,目標分子相對表達水平=目標蛋白條帶灰度值/內條帶灰度值。MDA含量水平檢測采用放射免疫法,血清 SOD檢測應用黃嘌呤氧化酶法,血清GSH-Px檢測應用二硫代二硝基苯甲酸法。

3.1.2 日常生活活動能力評分

應用改良 Barthel指數(MBI)評分評估日常活動能力,治療前后評估神經功能缺失情況,由康復科及神經內科醫師共同參與評定,取兩者總分的平均值。

3.1.3 CSI量表評分

CSI量表從陣攣、肌張力、腱反射3方面進行評定,總分16分,無痙攣為0～6分,輕度痙攣為7～9分,中度痙攣為10～12分,重度痙攣為13～16分。

3.1.4 MAS

MAS用來測量肌肉痙攣狀態,將肌張力進行分級(0～4級)。

3.1.5 FMA量表評分

FMA用以評估肢體運動功能,與日常生活功能關系密切,同時可以反映異常運動模式的變化,信度及效度較高。

3.2 療效標準[9]

主要觀察治療后卒中患者肌張力改善情況,參考MAS量表評分結果評定。

治愈:恢復正常肌張力水平。

顯效:肌張力下降≥2級。

有效:肌張力下降1級水平。

無效:肌張力治療后無改善或癥狀加重。

總有效率=[(治愈例數＋顯效例數＋有效例數)/總病例數]×100%。

3.3 統計學方法

試驗數據采用SPSS22.0統計學軟件進行處理。符合正態分布的計量資料以均數±標準差表示,組內比較采用配對t檢驗,組間比較使用獨立樣本t檢驗;不符合正態分布采用秩和檢驗。計數資料比較采用卡方檢驗;相關性采用Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 兩組治療前后CSI量表評分比較

兩組治療前CSI量表評分比較差異無統計學意義(P＞

0.05)。兩組治療后 CSI量表評分均較治療前降低(P＜0.05),且觀察組下降更為顯著(P＜0.05)。詳見表1。

表1 兩組治療前后CSI評分比較 (±s,分)

表1 兩組治療前后CSI評分比較 (±s,分)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 例數 治療前 治療后 差值對照組 4011.26±1.066.90±1.251)3.34±1.02觀察組 4011.02±1.116.14±1.221)2)4.79±1.722)

3.4.2 兩組治療前后MAS分級比較

兩組治療前MAS分級比較差異無統計學意義(P＞0.05)。兩組治療后MAS分級比較差異無統計學意義(P＞0.05)。詳見表2。

表2 兩組治療前后MAS分級比較 (例)

3.4.3 兩組治療前后FMA量表評分比較

兩組治療前后FMA量表評分比較差異無統計學意義(P＞0.05)。兩組治療后FMA量表評分較治療前升高(P＜0.05),且觀察組高于對照組(P＜0.05)。詳見表3。

表3 兩組治療前后FMA量表評分比較 (±s,分)

表3 兩組治療前后FMA量表評分比較 (±s,分)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 例數 治療前 治療后對照組 4030.96±9.8559.13±9.121)觀察組 4031.06±10.3964.77±8.451)2)

3.4.4 兩組治療前后MBI量表評分比較

兩組治療前MBI量表評分比較差異無統計學意義(P＞0.05)。兩組治療10 d、治療后MBI評分與治療前比較均顯著升高(P＜0.05),且觀察組高于對照組(P＜0.05)。詳見表4。

3.4.5 兩組臨床療效比較

觀察組總有效率(85.0%)顯著高于對照組(70.0%),差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表5。

表4 兩組治療前后MBI量表評分比較(每組40例)(±s,分)

表4 兩組治療前后MBI量表評分比較(每組40例)(±s,分)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05;與對照組比較2)P＜0.05

組別 治療前 治療10 d 治療后對照組images/BZ_39_1473_655_1679_704.pngimages/BZ_39_1714_655_1939_704.pngimages/BZ_39_1982_655_2207_704.png觀察組images/BZ_39_1473_726_1679_775.pngimages/BZ_39_1714_726_1957_775.pngimages/BZ_39_1982_726_2226_775.png

表5 兩組臨床療效比較 [例(%)]

3.4.6 兩組治療前后Keap1、Nrf2、ARE分子水平及血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較

兩組治療前 Keap1、Nrf2、ARE分子水平及血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。兩組治療10 d、治療后Nrf2和ARE表達水平均顯著升高(P＜0.05),而Keap1表達水平明顯下降(P＜0.05,P＜0.01),且觀察組明顯優于對照組(P＜0.05);兩組治療10 d、治療后SOD和GSH-Px水平均明顯升高,而 MDA水平降低(P＜0.05,P＜0.01),且觀察組改善更明顯,差異具有統計學意義(P＜0.05)。詳見表6,wb條帶圖見圖1。

表6 兩組治療前后Keap1、Nrf2、ARE分子水平及血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較 (±s)

表6 兩組治療前后Keap1、Nrf2、ARE分子水平及血清MDA、SOD、GSH-Px水平比較 (±s)

注:與同組治療前比較1)P＜0.05,2)P＜0.01;與對照組比較3)P＜0.05,4)P＜0.01

組別 例數 時間images/BZ_39_1146_1737_1239_1785.pngimages/BZ_39_1569_1737_1644_1785.pngimages/BZ_39_1993_1737_2050_1785.png對照組 40治療前images/BZ_39_1082_1810_1307_1858.pngimages/BZ_39_1497_1810_1722_1858.pngimages/BZ_39_1912_1810_2137_1858.png治療10 d images/BZ_39_1082_1881_1307_1929.pngimages/BZ_39_1497_1881_1722_1929.pngimages/BZ_39_1912_1881_2137_1929.png治療后images/BZ_39_1082_1952_1326_2001.pngimages/BZ_39_1497_1952_1741_2001.pngimages/BZ_39_1912_1952_2155_2001.png觀察組 40治療前images/BZ_39_1082_2025_1307_2074.pngimages/BZ_39_1497_2025_1722_2074.pngimages/BZ_39_1912_2025_2137_2074.png治療10 d images/BZ_39_1082_2096_1326_2145.pngimages/BZ_39_1497_2097_1759_2145.pngimages/BZ_39_1912_2096_2174_2145.png治療后images/BZ_39_1082_2168_1345_2217.pngimages/BZ_39_1497_2168_1759_2217.pngimages/BZ_39_1912_2168_2174_2217.png組別 例數 時間 MDA(μmol/L) SOD(NU/mL)images/BZ_39_1937_2243_2144_2291.png對照組 40治療前images/BZ_39_1101_2315_1308_2364.pngimages/BZ_39_1516_2315_1722_2364.pngimages/BZ_39_1912_2315_2156_2364.png治療10 d images/BZ_39_1101_2386_1326_2435.pngimages/BZ_39_1516_2386_1722_2435.pngimages/BZ_39_1912_2386_2156_2435.png治療后images/BZ_39_1101_2458_1326_2507.pngimages/BZ_39_1516_2458_1741_2507.pngimages/BZ_39_1912_2458_2156_2507.png觀察組 40治療前images/BZ_39_1101_2531_1308_2579.pngimages/BZ_39_1516_2531_1722_2579.pngimages/BZ_39_1912_2531_2156_2579.png治療10 d images/BZ_39_1101_2602_1326_2651.pngimages/BZ_39_1516_2602_1741_2651.pngimages/BZ_39_1912_2602_2174_2651.png治療后images/BZ_39_1120_2674_1345_2722.pngimages/BZ_39_1497_2674_1759_2722.pngimages/BZ_39_1912_2674_2174_2722.png

3.4.7 兩組Keap1、Nrf2、ARE分子表達水平與MBI評分結果相關性分析

治療前后兩組Nrf2、ARE表達水平與MBI評分結果呈正相關,Keap1與 MBI呈負相關(P＜0.05,P＜0.01),詳見圖2。

3.4.8 兩組患者細胞氧化應激反應指標與 Keap1表達水平相關性分析

治療前后兩組SOD、GSH-Px水平與Keap1表達均呈負相關,MDA與 Keap1表達呈正相關(P＜0.05,P＜0.01),詳見圖3。

圖1 wb條帶圖

圖2 兩組Keap1、Nrf2、ARE分子表達水平與MBI評分結果相關性分析

圖3 兩組患者細胞氧化應激反應指標與Keap1表達水平相關性分析

3.4.9 兩組患者細胞氧化應激反應指標與Nrf2表達水平相關性分析

治療前后兩組SOD、GSH-Px水平與Nrf2表達均呈正相關,MDA與Nrf2表達呈負相關(P＜0.05,P＜0.01),詳見圖4。

圖4 兩組患者細胞氧化應激反應指標與Nrf2表達水平相關性分析

4 討論

中樞神經系統疾病中氧化應激發病機制已成為研究熱點,研究證實卒中后Keap1-Nrf2/ARE氧化應激反應信號調節通路可激活下游因子,從而起到抗炎、抗凋亡、抗氧化應激損傷的作用。機體內起到抗氧化應激的重要調節中樞為Nrf2及接頭蛋白Keap1,抗氧化反應元件(ARE)與 Nrf2具有相互協調效應,能誘導編碼抗氧化蛋白的Ⅱ相解毒酶進行表達,保護細胞損傷,當機體受到氧化應激刺激后,會立即修飾 Keap1半胱氨酸殘基,下調 Nrf2穩定性,進而兩者發生解離,與核內ARE進行結合,同時與小Maf核蛋白進行結合后形成異二聚體,會激活SOD、GSH、NQO1等下游基因的表達,對抗氧化酶水平進行調控[9],Keap1-Nrf2/ARE調節通路還參與體內GSH合成、抗細胞凋亡、抗氧化應激的調節[10]。

眼針為治療卒中或其他全身疾病的特色療法,主要在眼眶周圍進行針刺達到治療目的。《素問·五藏生成》中有論述“諸脈皆屬于目”,提示眼部可作為頭面部的標結穴區。《靈樞·大惑論》中記載:“五臟六腑之精氣,皆上注于目而為睛。”說明五臟六腑的精氣匯注于目,是人體魂魄、精神、氣血、營衛之所藏,與臟腑經絡氣血運行關系緊密[11]。因此在眼眶及眼球周圍施針,可起到調節臟腑氣血、安神定志、化瘀止痛、疏經通絡的功效。眼睛與全身臟腑通過網絡全身、縱橫交錯的經脈系統相互聯系,可通過眼針治療對上、下焦區產生刺激,進而疏通上、下肢氣血,有助于肢體功能改善及恢復。研究[12]證實,卒中后肢體痙攣患者通過眼針治療卒中偏癱患者是整體與局部辨證結合的過程,作用于中樞神經系統,產生不同類型的生理刺激,進而重組相關突觸鏈功能,起到“疏通氣血、調和經脈、培本固元”的作用,改善癥狀。現代醫學研究表明,眼睛每個穴區內含有大量豐富的感傳神經,通過刺激可將信號傳入大腦中樞,調節神經功能達到治病效果。研究證實在左、右眼16個穴區皮下淺筋膜內分布有豐富的血管網(含有內臟感覺神經末梢)及軀體感覺神經,通過針刺可沿各自的感覺神經將沖動傳遞至中樞,這也是眼針穴區辨證與臟腑相互關聯的理論基礎。通過眼針治療卒中,腦組織血液循環改善明顯,缺血灶血供明顯增加,進而起到治療目的[13]。有研究證實眼針可顯著改善關節功能、恢復肌張力,進而提高日常生活能力[14]。臨床經驗證明運用眼針治療符合人體運動、神經生理,遵循Brunstrom偏癱治療的恢復原理,具有顯著療效[15]。

卒中后患肢肌會發生痙攣,主要由肌張力增高引起,隨著病情發展會降低,Bruustrom分級為Ⅲ級及Ⅳ級時是卒中后肢體功能恢復的關鍵時期[16]。本研究對這一時期的患者進行治療,比較 CSI、FMA量表評分,眼針配合 NMES治療卒中后評分結果改善優于單純NMES治療,并且治療總有效率較對照組顯著提高,提示治療卒中后肢體痙攣,眼針配合NMES具有明顯的臨床優勢。并且在前期研究基礎上證實,通過眼針治療可以對卒中后的神經功能缺失病理改變有促進恢復作用,且有顯著抗炎作用,并對免疫功能進行調節[17],其治療機制可能為通過提高機體 SOD、GSH-Px生物學活性,而下調MDA含量,進而起到拮抗氧自由基受損[18]。本研究結果提示,治療后觀察組 MBI評分較對照組顯著提高,臨床療效較好。觀察組經治療后較對照組,PBMC中的Keap1水平明顯下降,Nrf2、ARE分子表達水平顯著提高,證明常規療法及眼針治療均可以對 Keap1-Nrf2/ARE氧化應激信號通路進行調控,調節相關因子的表達水平。治療后與相同時間點比較,觀察組患者Keap1表達水平降低,PBMC中的Nrf2、ARE表達水平升高較對照組顯著,證明觀察組治療后的調控作用優于對照組。并且相關性分析表明,Keap1-Nrf2/ARE氧化應激信號通路中相關因子表達水平與MBI評分結果呈明顯的相關性,表明PBMC中的Keap1、Nrf2、ARE分子表達水平可以反映機體細胞氧化應激反應的嚴重程度,也證明PBMC中的Keap1-Nrf2/ARE氧化應激信號通路中的相關因子在卒中發病機制中起到重要影響。SOD可以清除機體內的氧自由基,與各種疾病及生理病理變化聯系緊密,具有抗衰老、抗福射、抗病毒、抗炎的作用[19]。SOD一直是臨床研究的熱點,已經成為氧化應激致病的治療新靶點。SOD由蛋白質與金屬輔酶構成,根據金屬輔酶可分為不同亞型(ZnSOD、CuSOD、MnSOD)。SOD有3種(SOD1-3)存在形式,ZnSOD、胞漿內Cu-SOD,線粒體內MnSOD,細胞外MnSOD。可作用于歧化反應過程,轉化超氧自由基為水、H2O2,在GSH-Px作用下H2O2可進一步轉化為水,起到抗氧化應激損傷的作用[20]。MDA為不飽和脂肪酸、氧自由基的過氧化產物,其含量水平可反映出氧自由基的表達含量,同時可用來評估抗氧化治療的療效,因此監測體內 MDA含量對卒中患者有重要意義,而且降低氧化自由基含量成為治療卒中新靶點。兩組治療后SOD、GSH-Px水平均明顯升高而MDA水平降低,且觀察組改善更明顯,同時兩組SOD、GSH-Px水平與Nrf2表達水平呈正相關,與Keap1呈負相關;兩組 MDA水平與 Nrf2表達水平呈負相關,與Keap1呈正相關,表明Keap1、Nrf2、ARE分子表達水平可以反映機體細胞氧化應激反應的嚴重程度,也表明 Keap1-Nrf2/ARE通路調節相關因子在卒中后抗氧化應激發病機制中起到重要影響。

綜上,眼針配合NMES治療在改善卒中患者運動功能、肢體痙攣狀態等方面優勢明顯,可有效提高生活質量,有助于肢體功能的恢復,機制可能為通過眼針治療,干預Keap1-Nrf2/ARE通路調節,上調Nrf2、ARE等機體保護因子,下調Keap1等有害性因子表達水平,進而改善腦組織缺血再灌注損傷,減輕機體細胞氧化損傷,促進日常生活能力恢復。