殼低聚糖對PM2.5 所致急性肺損傷的保護作用研究

游 航，唐 華，唐 華

隨著我國工業化與城市化水平快速發展，霧霾已成為我國面臨的一大難題。 暴露于過量的顆粒物(particulate matter，PM)中可增加罹患各種疾病的風險，導致死亡率上升[1]。 短期內大量接觸PM 會提高因呼吸系統疾病而住院的風險。 2 d 內PM 的平均濃度升高10 μg/m3將會增加2.07%的呼吸系統相關疾病住院率[2]。 相反，當PM 平均濃度降低10 μg/m3時，平均壽命將會增加0.35年[3]。 PM 中導致肺組織損傷的主要成分是空氣動力學直徑≤2.5 μm 的細顆粒物(PM2.5)。 目前已有許多研究探討PM2.5 對肺組織損傷的機制，伍曉麗等[4]發現PM2.5 引起肺組織損傷的機制主要是誘導氧化應激和炎癥反應。 PM2.5 中的Mn、Zn、Pb 等金屬成分可引起肺上皮細胞氧化應激，大量產生并釋放脂質過氧化物，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)則顯著降低[5-6]。 PM2.5 上附著的多種病原體導致肺組織產生炎癥并顯著提高肺組織中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的濃度[7]。 殼低聚糖也稱殼寡糖，是殼聚糖經過特殊處理降解得到的聚合度為2～10 的氨基葡萄糖低聚物[8]。 由于殼低聚糖糖鏈短，所以具有溶解性好和生理條件下粘度低的特點。 殼低聚糖具有抑菌、抗氧化應激、抗炎和免疫調節作用，也可以促進細胞修復和傷口愈合[9]。 本研究主要探討殼低聚糖對PM2.5 暴露下急性肺損傷(acute lung injury，ALI)的干預作用，為治療PM2.5 所致ALI 的臨床用藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、材料與儀器

1.1.1 動物 選用(30±2)g 雄性昆明種小鼠。 實驗動物來自西南醫科大學SPF 級動物中心，生產許可證號:SYXK(川)2018-065。

1.1.2 材料與試劑 殼低聚糖(脫乙酰度＞90%，分子量＜3000)購自山東奧康生物科技有限公司；總蛋白(TP)檢測試劑盒、LDH、TNF-α ELISA 試劑盒購自南京建成生物工程研究所；蛋白酶抑制劑購自上海羅氏制藥有限公司。

1.1.3 儀器與設備 低速離心機(TDZ6B-WS，上海盧湘儀離心機有限公司)；超聲波清洗器(KB-250B，40 kHz，250 W，昆山舒美超聲儀器有限公司)；K-C120H 型智能中流量采樣器(青島宜蘭環保股份有限公司)；濾膜(d＝0.15 μm，上海興亞凈化材料廠)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5 樣品采集和懸液制備 顆粒物采樣點在西南醫科大學圖書館樓頂，采集時間2018年12 月，連續采集1 個月。 無菌條件下將濾膜切至1 cm×3 cm 小片，浸泡在蒸餾水中，超聲波震蕩3 次，每次20 min，充分洗脫顆粒物。 含顆粒物液體經8層無菌紗布過濾，以轉速12000 r/min，離心20 min。離心后的沉淀物經真空冷凍干燥后在-20 ℃保存。將顆粒物溶解于生理鹽水，制成10 mg/mL 的PM2.5 混懸液，4 ℃保存。

1.2.2 小鼠分組與造模 健康雄性昆明種小鼠30只，隨機分為5組，每組6 只，即空白對照組、ALI組、低劑量治療組、中劑量治療組及高劑量治療組。適應性飼養1 周后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉，以10 mg/mL PM2.5 懸液進行氣管滴注。 空白對照組用等量生理鹽水代替，1 /d，連續3 d。

1.2.3 小鼠給藥 末次染毒24 h 后，低、中、高劑量治療組參考Liu 等[10]和郭劍平等[11]的方法，分別用濃度為10、20 和40 mg/mL 的殼低聚糖溶液灌胃，1 /d，連續10 d，空白對照組和ALI組用等量生理鹽水代替。 最后一次灌胃24 h 后處死所有小鼠。

1.3 標本采集和指標檢測

1.3.1 肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF) 用4 ℃預冷的無菌生理鹽水對左肺進行肺泡灌洗，每次0.6 mL，共3 次；全部收集后離心(3000 r/min，10 min)，取上清液檢測LDH，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.2 肺組織勻漿 取右肺0.3 g，在冰浴中，用組織剪剪碎后加入9 倍體積預冷生理鹽水，再加入1體積的酶抑制劑，研磨制成勻漿，離心(3500 r/min，10 min)，取上清液檢測LDH 和TNF-α，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.3 心臟血清 取血1 mL，在室溫下靜置30 min 后離心(3000 r/min，10 min)，取上清液，檢測SOD，嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.3.4 肺組織病理切片 取余下右肺組織，用20倍體積質量分數為10%的甲醛溶液固定，48 h 后送至西南醫科大學附屬第一醫院病理科制作病理學切片和HE 染色，觀察肺組織形態學變化。

1.4 統計學處理 應用SPSS 17.0 和Graph Pad 8.0 軟件進行統計分析。 計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組間比較使用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理切片形態學觀察 對照組肺泡結構完整，大小分布均勻，肺泡間隔無增厚，肺泡腔無炎性滲出(圖1A)。 ALI組未見完整肺泡結構，分布紊亂，肺泡間隔明顯增厚，肺泡腔內有炎性滲出物伴有大量中性粒細胞炎性浸潤(圖1B)。 ALI組可見PM2.5 分散顆粒物沉積于氣管灌注后的肺泡區，被肺巨噬細胞吞噬，表明PM2.5 可以到達肺泡區(圖1C)。 低劑量治療組肺泡大部分融合，但可見部分正常肺泡結構，肺泡間隔增厚減輕，肺泡腔內炎性滲出減少(圖1D)。 中劑量治療組大部分的肺泡結構完整，分布較均勻，間隔增厚明顯減輕，肺泡腔內滲出物少，伴輕微中性粒細胞浸潤(圖1E)。 高劑量治療組正常肺泡結構少，多數肺泡融合，肺泡炎性滲出和中性粒細胞浸潤減輕(圖1F)。 結果表明，殼低聚糖能明顯改善PM2.5 所致的肺損傷。 其中中劑量治療組效果相較于其他兩個治療組效果更好。

2.2 殼低聚糖對PM2.5 暴露下肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的影響 與空白對照組比較，ALI組BALF 和肺組織勻漿中LDH 活性均顯著增高(P＜0.01)，TNF-α 含量也明顯升高(P＜0.01)，同時SOD 活性顯著降低(P＜0.01)。 與ALI組比較，低、中、高劑量治療組LDH 活性(BALF)分別降低8.68 U/gprot、10.51 U/gprot、8.70 U/gprot(P＜0.01)；LDH 活性(肺組織勻漿)分別降低59.56 U/g、79.53 U/g、47.20 U/g(P＜0.01)；TNF-α 含量分別降低111.70 pg/mL、222.60 pg/mL、116.60 pg/mL(P＜0.01)；SOD 活性分別升高36.52 U/mL、32.50 U/mL、19.52 U/mL(P＜0.01)。 各治療組間比較，中劑量治療組BALF 以及肺組織勻漿中LDH活性和TNF-α 含量降低更明顯(P＜0.01)；低劑量治療組SOD 活性升高更顯著(P＜0.05)，圖2。

圖1 肺組織病理學改變(×200 倍)

圖2 各組肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性測定結果

3 討論

有研究表明，PM2.5 造成ALI 的機制主要包括氧化應激和炎癥反應[12]。 TNF-α 是公認的促炎細胞因子，在炎癥反應過程中產生早且作用顯著，它通過激活NF-κB 傳導通路，誘導IL-1B、IL-6 等多種炎性細胞因子釋放，加快炎癥反應進程，增加趨化因子的表達，呈現出級聯瀑布效應[13]，進而造成組織細胞損傷[14]。 LDH 是一種胞質酶，在質膜損傷時大量釋放[15]。 臨床上常通過檢測LDH 活性水平來輔助診斷組織器官損傷[16]。 SOD 是體內重要的抗氧化因子，其水平的提高被視為清除自由基的重要細胞防御機制[17]。 殼低聚糖糖鏈較短，分子量小，所以具有溶解性好，生理條件下粘度低的特點。 Zhang等[18]發現，殼低聚糖能有效地清除羥基自由基和超氧自由基。 Gai 等[19]發現在人臍靜脈內皮細胞中，一定劑量的殼低聚糖不僅能抵抗過氧化氫的強氧化，而且能增加SOD 和谷胱甘肽過氧化物酶的含量，從而抑制過氧化氫等氧化物誘導的活性氧生成。Chen 等[20]發現殼低聚糖能增強靜息中性粒細胞的活性，抑制中性粒細胞的過度活化，以保護身體免受急性炎癥。 本研究旨在驗證服用殼低聚糖可以減輕PM2.5 所致ALI 的假設。 殼低聚糖對PM2.5 暴露下肺組織中LDH、TNF-α 和血清中SOD 活性的變化及肺組織形態學觀察結果表明:殼低聚糖可以通過降低肺組織中LDH 活性和TNF-α 水平，來減輕PM2.5 對肺組織的炎性損傷；還可以通過升高抗氧化因子SOD 的活性來減輕PM2.5 引起的氧化應激損傷。 另外，結果顯示，肺組織勻漿和BALF 中的LDH 活性以及TNF-α 含量均在中劑量治療組中降低最為顯著，這與肺組織病理形態學改變結果一致。而肺組織勻漿中SOD 活性卻在低劑量治療組中增高最明顯。 對于造成這種不同趨勢的原因，本研究推測:①殼低聚糖對PM2.5 暴露下肺損傷的保護作用可能主要通過抗炎癥反應來實現；②殼低聚糖對PM2.5 暴露下肺損傷的保護作用機制隨濃度不同而存在差異，即在低濃度時，可能主要通過抗氧化應激，而在較高濃度時，則主要通過抗炎性損傷。 Timmerman 等[21]發現BALF 中炎癥細胞分類計數可定量反映肺炎癥反應，通過檢測各組BALF 中的炎癥細胞分類計數可進一步驗證本研究結果。

綜上所述，本研究結果初步表明殼低聚糖可通過降低炎性損傷和抗氧化應激減輕PM2.5 所致的肺損傷，且保護作用與給藥劑量存在一定的量效關系。 相關作用機制尚待進一步研究證實。