PI3K 在妊娠期糖尿病發(fā)病機(jī)制中的作用生物信息分析及驗證

李 明，段世博，侯秀真，張榮菊，黨萬里，鄭新英，金 燕

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus，GDM)是指妊娠期發(fā)生或首次發(fā)現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常。 相關(guān)流行病學(xué)報道，其發(fā)病率存在較大差異(1%～14%)，較為一致的結(jié)果是其發(fā)病率近年來出現(xiàn)了明顯的上升趨勢[1-2]。 我國尚缺乏系統(tǒng)的全國范圍內(nèi)的GDM 發(fā)病率數(shù)據(jù)，但區(qū)域相關(guān)流行病學(xué)研究認(rèn)為，GDM 發(fā)病率約為5%，而約1/4 ～3/4 GDM 患者會出現(xiàn)各種母嬰并發(fā)癥[3]。 同時，首次妊娠發(fā)生GDM，則二次妊娠GDM 發(fā)生率高達(dá)35.6%～69.0%，其后代成年后患2 型糖尿病的危險明顯增高[2]。 GDM 發(fā)病具體機(jī)制至今尚無定論，相關(guān)研究結(jié)論也不一致。 大多數(shù)研究認(rèn)為GDM 的發(fā)生與胰島素抵抗和胰島B 細(xì)胞分泌降低有關(guān)，其中遺傳基因易感性、胰島素信號系統(tǒng)障礙可能是發(fā)病基礎(chǔ)[4]。 因此，篩選GDM 相關(guān)基因，預(yù)測其功能有望成為預(yù)防和治療GDM 的關(guān)鍵靶點。

1 數(shù)據(jù)與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫選擇 分別選取基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus，GEO)[5]，用于對篩選出的差異基因進(jìn)行生物功能富集分析；蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫STRING[7]用于構(gòu)建篩選差異表達(dá)基因的互相作用；Cytohubb 軟件[8]，用于對STRING 構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)中篩選關(guān)鍵基因。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)篩選 首先對選入的數(shù)據(jù)集進(jìn)行數(shù)據(jù)下載，采用R 軟件Lima 包對差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，篩選條件為基因差異表達(dá)大于2 倍(Log2FC ＞1)，容錯率為5%(P＜0.05)。

1.2.2 功能富集分析 基因本體論(Gene Ontology，GO)[9]和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEEG)分析[10]，預(yù)測其可能功能及信號通路。

1.2.3 蛋白網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及hub 基因篩選 采用STRING 分析篩查出的差異表達(dá)基因編碼蛋白間的相互作用關(guān)系。 篩選條件為:相互作用來源Textmining，Co-expression，Neighborhood，Gene Fusion 和Cooccurrence；相互作用數(shù)值＜50；置信度0.4。

1.2.4 免疫組化 驗證選取30 例GDM 患者和30名正常分娩孕婦為研究對象，采用免疫組化方法對關(guān)鍵基因編碼蛋白在GDM 患者胎盤組織及正常妊娠產(chǎn)婦胎盤組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測。 染色強(qiáng)度:細(xì)胞著色強(qiáng)度則以多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色(棕黃色)計分。 未著色或與背景一致淺棕色為0 分；強(qiáng)著色:著色強(qiáng)度和己知陽性切片相同計3 分；淺著色:著色淺、但與陰性對照切片有明顯區(qū)別計1 分；染色強(qiáng)度在淺著色和強(qiáng)著色之間者為中等著色計2分。 陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù):高倍鏡(×400)下隨機(jī)選取10個視野，每個視野計數(shù)10 個細(xì)胞，取平均值作為陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。 小于5%的細(xì)胞呈陽性或細(xì)胞顯色與背景一致計0 分；弱陽性:5%～25%的細(xì)胞呈陽性計1 分；陽性:26%～50%的細(xì)胞呈陽性計2 分；強(qiáng)陽性:大于51%的細(xì)胞呈陽性計3 分。 根據(jù)這兩項指標(biāo)的積分和分為4 級，即陰性(-)為0 分，弱陽性(＋)為1～2 分，陽性(＋＋)為3～4 分，強(qiáng)陽性(＋＋＋)為5～6 分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用STATA 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，兩組間比較使用t 檢驗，多組間比較使用單因素方差分析；計數(shù)資料用率表示，行χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異表達(dá)基因篩選 共2 個數(shù)據(jù)集GSE51546(https:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.aglacc＝GSE5154t)[11]和GSE87295 (https:/ /www. ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi)納入本次分析，2 個數(shù)據(jù)集中共差異表達(dá)基因4 個[TACSTD2，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositide 3-kinase，PI3K)，COLEC12 和IGFBP6]，圖1。

圖1 差異表達(dá)基因篩選

2.2 層次聚類分析 GDM組與對照組呈現(xiàn)出明顯的相關(guān)基因聚類表達(dá)。 4 個基因中GDM 患者和對照組中均呈現(xiàn)明顯的聚類趨勢，圖2。

圖2 篩選出的4 個差異表達(dá)基因的聚類熱圖

2.3 差異表達(dá)基因的功能富集 上述差異表達(dá)基因產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞接合器，主要分子功能為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，醇基作為受體和蛋白激酶，主要參與體內(nèi)相關(guān)蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。 KEGG 通路分析顯示，差異基因主要參與了PI3K-AKT 信號通路、糖代謝途徑相關(guān)通路和胰島素信號通路，表1。

表1 基因功能富集分析

圖3 差異表達(dá)基因蛋白-蛋白相關(guān)作用互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 差異表達(dá)基因蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 篩選出的4 個差異表達(dá)基因編碼蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(圖3)顯示，整個網(wǎng)絡(luò)中54 個蛋白節(jié)點，共574 個相互作用鏈接，平均連接度為21.3，聚集度為0.74。2.5 GDM 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因篩選 根據(jù)蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出PI3K、TAL1 和LYL1為GDM 差異表達(dá)蛋白-蛋白網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵基因，其中PI3K 在3 個關(guān)鍵基因中作用最為重要，圖4。

圖4 GDM 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵基因篩選

2.6 免疫組化驗證結(jié)果 PI3K 陽性表達(dá)細(xì)胞為合體滋養(yǎng)細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)均勻一致棕黃色顆粒，細(xì)胞核不著色。 GDM組中，PI3K 陽性表達(dá)21 例，其中(＋)12 例，(＋＋)6 例，(＋＋＋)3 例，陽性表達(dá)率為70.0%(21/30)；正常妊娠組陽性表達(dá)率為100%(30/30)。 GDM組中PI3K 的陽性表達(dá)低于正常妊娠組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2＝22.47，P＜0.01，表2)。

表2 PI3K 在GDM組與正常妊娠組中的表達(dá)

3 討論

GDM 是臨床中最為常見的一類妊娠合并癥，其發(fā)病率在不同地區(qū)不同年齡妊娠人群中存在較大差異。 同時，其確切發(fā)病機(jī)制仍不完全清楚。 目前研究認(rèn)為其發(fā)病主要是隨著孕周的增加，到妊娠中、晚期，孕婦體內(nèi)抗胰島素樣物質(zhì)增加，如胎盤生乳素、雌激素、孕酮、皮質(zhì)醇和胎盤胰島素酶等使孕婦對胰島素的敏感性隨孕周增加而下降，從而出現(xiàn)血糖升高。

生物信息大數(shù)據(jù)挖掘能夠?qū)σ延械南嚓P(guān)基因芯片和測序數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選和二次分析。 根據(jù)不同的需要設(shè)置篩選條件，從而得出相應(yīng)的結(jié)論，為臨床相關(guān)疾病的診斷、治療和基礎(chǔ)研究提供思路和方向[12-13]。生物信息學(xué)分析是進(jìn)行臨床及基礎(chǔ)研究不可或缺的重要信息學(xué)手段。 近年來隨著基因表達(dá)譜芯片及二代測序技術(shù)的不斷進(jìn)展，產(chǎn)生了海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)，為生物信息學(xué)技術(shù)深入分析提供了基礎(chǔ)。 本研究中，入選了2 個關(guān)于GDM 的數(shù)據(jù)集并進(jìn)行篩選，同時對差異表達(dá)的基因進(jìn)行重疊分析，對2 個數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因進(jìn)行研究。 2 個數(shù)據(jù)集中差異表達(dá)基因4 個(TACSTD2，PI3K，COLEC12 和IGFBP6)。這些差異基因表達(dá)蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞接合器，主要分子功能為磷酸轉(zhuǎn)移酶活性，醇基作為受體和蛋白激酶參與了PI3K-AKT 信號通路、糖代謝途徑相關(guān)通路和胰島素信號通路。 其中PI3K 在GDM網(wǎng)絡(luò)中作為最關(guān)鍵的基因發(fā)揮重要的作用。 同時免疫組化也證實PI3K 蛋白在GDM 患者和正常妊娠產(chǎn)婦胎盤中存在明顯的差異表達(dá)。

在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，胰島素受體底物蛋白激活PI3K 主要與胰島素的代謝效應(yīng)有關(guān)。 在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，胰島素刺激引起的PI3K 信號傳導(dǎo)途徑作用下降，而MAPK 介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)作用則正常[14-15]。 胰島素的代謝功能和血糖調(diào)節(jié)主要受胰島素受體/胰島素受體底物-1/PI3K/磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶/蛋白激酶B(AKT)/葡萄糖轉(zhuǎn)移因子4(GLUT4)信號路徑的影響，即PI3K-AKT 信號通路。 所以當(dāng)信號路徑中任意一個信號分子或環(huán)節(jié)發(fā)生異常時均可導(dǎo)致糖尿病。

因此，PI3K 在GDM 患者中存在明顯的差異表達(dá)，并可能在GDM 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。PI3K 可能成為治療和預(yù)防GDM 的關(guān)鍵靶點。