載阿霉素細胞膜納米囊泡對黑色素瘤B16F10 細胞的殺傷效應

楊澤斌,王明月,陳麗,劉寧,王浩,崔梅英,方楷漪,夏薇,關新剛

（北華大學醫(yī)學技術學院腫瘤靶向治療重點實驗室，吉林 吉林 132013）

阿霉素（doxorubicin，DOX），又稱多柔比星，是一種具有廣譜抗腫瘤活性的蒽環(huán)類抗生素，廣泛應用于乳腺癌、胃癌、肝癌、宮頸癌、膽管癌和前列腺癌等實體瘤及多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療。盡管在多種腫瘤中顯現(xiàn)出良好的治療效果，但DOX 用藥過程中產(chǎn)生的心臟毒性及骨髓抑制等嚴重不良反應限制了其在臨床上的進一步應用［1］。提高DOX 的靶向腫瘤輸送效率并降低對正常組織的不良反應成為改善治療效果的關鍵。近年來，基于納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)引起了廣泛關注［2］，與游離小分子藥物比較，納米藥物遞送系統(tǒng)具有藥物代謝時間延長、肝腎組織吸收降低、高通透性和滯留（EPR）效應［3-5］等優(yōu)勢。多項研究［6-8］顯示：利用細胞膜為原材料制備的納米囊泡具有極佳的生物相容性，可作為一種高效安全的藥物遞送系統(tǒng)用于抗腫瘤研究。細胞膜納米囊泡擔載紫杉醇（paclitaxel，PTX）用于惡性膠質(zhì)母細胞瘤治療，與小分子PTX 比較，納米藥物能明顯延長藥物的體內(nèi)循環(huán)時間并減輕不良反應［9］；此外，利用膜囊泡作為siRNA 遞送載體，能夠改善siRNA 在血液中的快速降解，明顯抑制c-Myc 基因表達［10］。本研究利用人胚腎細胞HEK293T 的細胞膜制備一種細胞膜納米囊泡（nanovesicle，NVs），通過電穿孔法將DOX 擔載于囊泡內(nèi)腔，得到新型阿霉素納米藥物NVs-DOX，探討納米藥物NVs-DOX 對黑色素瘤B16F10 細胞的內(nèi)吞作用及殺傷效應，為開發(fā)高效低毒的新型抗癌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器小鼠黑色素瘤B16F10 細胞、人胚胎腎細胞HEK293 和小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3 由本實驗室保存。DOX、MTT、PMSF、DAPIT 和BCA 蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術公司，二甲基亞砜（DMSO）、DMEM 和胎牛血清（FBS）購于生工生物工程（上海）股份有限公司，活/死細胞活力檢測試劑盒購于凱基生物。納米粒度及Zeta 電位分析儀Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ（美國麥奇克有限公司），LF10 脂質(zhì)體擠出儀（加拿大AVESTIN 公司），M200 多功能酶標儀（瑞士TECAN 公司），CUY21EDIT Ⅱ細胞電轉(zhuǎn)化儀（日本BEX 公司），紫外分光光度計（上海儀電INESA 有限公司），ACEA NovoCyte 序列流式細胞儀和倒置熒光顯微鏡（美國Lifte-Technologies 公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)細胞在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育，用含10%FBS 和1% 雙抗混合液（penicillinstreptomycin solution）的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細胞膜NVs制備將對數(shù)生長期的HEK293T 細胞進行消化后，離心收集細胞沉淀用PBS 緩沖液洗滌3 次（1 500 r·min－1，5 min），使用HM 培養(yǎng)基（1 mmol·L－1EDTA、20 mmol·L－1Hepes-NaOH、pH7.4、1 mmol·L－1PMSF）進行重懸，冰上使用勻漿器擠壓50 次，1 500 r·min－1離心10 min，收集上清超高速離心（35 000 r·min－1，2 h）收集沉淀，PBS 緩沖液重懸3 次后順序通過裝有1 μm 和0.4 μm 濾膜的擠出儀擠壓20 次，得到細胞膜NVs，利用BCA 蛋白定量試劑盒檢測囊泡中蛋白濃度，細胞膜NVs 濃度以蛋白濃度（mg·L－1）表示。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ檢測NVs的粒徑分布。

1.4 MTT 法分析NVs 的細胞相容性取對數(shù)生長期小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3，消化后接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后每孔加入終濃度分別為0、5、10、20、50 和100 mg·L－1（蛋白濃度）的NVs，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h 后每孔加入20 μL MTT（5 g·L－1）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后棄去孔中溶液，加入150 μL DMSO，震蕩1 min 后檢測490 nm 處吸光度（A）值并計算細胞存活率。細胞存活率＝NVs 組A 值/空白組A 值×100%。

1.5 納米藥物NVs-DOX 的制備利用電轉(zhuǎn)法將DOX 擔載于細胞膜內(nèi)腔：CUY21EDIT Ⅱ細胞電轉(zhuǎn)化儀電擊杯（內(nèi)徑尺寸為0.4cm）加入細胞膜NVs 與DOX（質(zhì)量比為2∶1），電轉(zhuǎn)條件為PPV：200 V，On：10 ms，Off：10 ms，PdV：25 V，On：50 ms，Off：50 ms，C：940 μF，Cycle：10。冰上孵育30 min，35 000 r·min－1超高速離心2 h 后將沉淀重懸于PBS 緩沖液，得到NVs-DOX；孵育方法裝載DOX，將細胞膜與DOX（質(zhì)量比2∶1）37℃孵育2 h，PBS 緩沖液洗滌3 次后重懸，利用DOX 在485 nm 吸光度（A）值繪制標準曲線，對上述2 種方法制備的納米藥物DOX 濃度進行定量。使用Microtrac Nanotrac Wave Ⅱ測定NVs-DOX 的粒徑分布。

1.6 激光共聚焦成像檢測細胞中熒光分布將對數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10 細胞消化后，接種于24 孔細胞培養(yǎng)板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育12 h 后，分別加入10 mg·L－1（DOX 濃度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 棄去孔中培養(yǎng)液，PBS 緩沖液清洗3 次后4%多聚甲醛37℃固定20 min，PBS 緩沖液清洗3 次后DAPI 室溫染色10 min，PBS 緩沖液清洗3 次后封片于熒光顯微鏡（Zeiss）下成像。采用Image J 軟件分析圖片熒光強度。

1.7 流式細胞術檢測細胞中熒光強度將B16F10 細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1.8×105個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，分別加入10 mg·L－1（DOX 濃度）的小分子DOX 或NVs-DOX，37℃孵育3 h 后胰蛋白酶消化，1 500 r·min－1離心5 min，收集細胞沉淀，PBS 緩沖液清洗3 次后加入500 μL PBS 緩沖液輕輕混勻重懸，采用流式細胞儀檢測并分析B16F10 細胞內(nèi)吞后的熒光強度。

1.8 MTT 法檢測NVs-DOX 作用后B16F10 細胞存活率取對數(shù)生長期的小鼠黑色素瘤B16F10 細胞，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，實驗組每孔加入100 μL NVs-DOX，藥物終濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.050、0.100、0.500 和1.000 μmol·L－1，對照組加入相同終濃度的游離DOX，每組設置5 個重復孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。棄上清，加入20 μL MTT（5 g·L－1），37℃、5%CO2孵育4 h。棄上清，每孔加入150 μL DMSO，使用全波長多功能自動酶標儀檢測490 nm 處A 值，計算細胞存活率。細胞存活率＝藥物處理組A 值/空白對照組A 值×100%。

1.9 活/死細胞染色檢測NVs-DOX 對B16F10 細胞的毒性取對數(shù)生長期的黑色素瘤B16F10 細胞，接種于96 孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h 后，分別加入含有1 μmol·L－1DOX 的小分子DOX 及NVs-DOXs，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基后PBS緩沖液沖洗2 次，加入活/死細胞活力檢測試劑盒進行染色，熒光顯微鏡成像，使用Image J 軟件分析數(shù)據(jù)。計算各組死細胞占總細胞比率。

1.10 統(tǒng)計學分析采用Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組細胞存活率、載藥效率、熒光強度和死細胞占總細胞比率經(jīng)正態(tài)分布檢驗均呈正態(tài)分布，以表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞膜NVs 的制備通過超速離心法得到HEK293 細胞的細胞膜，脂質(zhì)體擠出儀處理后得到細胞膜NVs，動態(tài)光散射檢測結果顯示：NVs 平均粒徑為254.3 nm（圖1）。MTT 法檢測結果顯示：隨著NVs 濃度逐漸增加，NVs 不僅未顯示出細胞毒性，而且在一定程度上促進了NIH3T3 細胞的增殖（細胞存活率＞120%）（表1），顯示出良好的生物相容性。

圖1 細胞膜NVs 的粒徑分布Fig.1 Size distribution of cell membrane NVs

表1 細胞膜NVs 與NIH3T3 細胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

表1 細胞膜NVs 與NIH3T3 細胞的生物相容性Tab.1 Biocompatibilities of cell membrane NVs and NIH3T3 cells(n＝5,，η/%)

2.2 納米藥物NVs-DOX 的制備動態(tài)光散射檢測結果顯示：裝載DOX 后的NVs 平均粒徑為289.6 nm（圖2），較空NVs 粒徑（254.3 nm）略大。電轉(zhuǎn)法DOX 擔載效率（24.91%±2.26%）高于孵育法（15.10%±0.73%，P＜0.05），與參考文獻［11］報道一致，因此在后續(xù)研究中均采用電轉(zhuǎn)法進行藥物擔載。

圖2 納米藥物NVs-DOX 的粒徑分布Fig.2 Size distribution of NVs-DOX

2.3 激光共聚焦成像和流式細胞術檢測NVs-DOX 的腫瘤細胞內(nèi)吞熒光成像檢測結果顯示：藥物孵育3 h 后小分子DOX 和納米藥物NVs-DOX均可以快速進入胞內(nèi)，主要分布在細胞核中（圖3）；熒光定量分析顯示：小分子DOX 組細胞的熒光強度（38.81±1.58）高于NVs-DOX 組（30.20±3.81）（P＜0.05）。流式細胞術檢測結果顯示：小分子DOX 細胞內(nèi)吞效率（95.47%±1.32%）高于NVs-DOX組（91.07%±0.42%），與熒光成像結果一致，見圖4。

2.4 MTT 法和活死細胞染色法檢測NVs-DOX 對黑色素瘤B16F10 細胞的毒性MTT 法檢測結果顯示：隨著藥物濃度增加，小分子DOX 和NVs-DOX 處理的細胞存活率均逐漸降低；不同濃度NVs-DOX 組細胞存活率與相對應濃度小分子DOX 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5）。活/死細胞染色法檢測結果顯示：處理24 h 后小分子DOX 組與NVs-DOX 組死細胞占總細胞比率分別為（41.14±3.13）%和（43.38±5.41）%（圖6），2 組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討論

晚期黑色素瘤由于高侵襲性和強轉(zhuǎn)移性，其臨床治療仍是一個亟待解決的難題［12］。降低DOX 的嚴重不良反應成為影響治療效果的關鍵問題［13］。近年來基于納米顆粒的藥物遞送系統(tǒng)取得了重要進展，已開發(fā)出脂質(zhì)體納米粒、納米膠束、納米囊泡、金納米顆粒和介孔納米硅球等載藥體系用于靶向腫瘤遞送DOX 研究［14-19］。然而藥物載體在體內(nèi)的代謝去向及安全性仍是不容忽視的問題。

圖4 流式細胞術檢測NVs-DOX 的黑色素瘤B16F10 細胞內(nèi)吞Fig.4 Endocytosis of melanoma B16F10 cells of NVs-DOX detected by flow cytometry

圖5 MTT 法檢測各組黑色素瘤B16F10 細胞存活率Fig.5 Survival rates of melanoma B16F10 cells in various groups detected by MTT method

細胞膜來源的NVs 由于其獨特的材料特性在藥物輸送領域引起了廣泛關注［20］。研究［21］顯示：利用細胞膜制備的NVs 擔載姜黃素不僅能夠改善姜黃素藥物溶解度差的問題，還能延長姜黃素的體內(nèi)循環(huán)時間，取得了較游離藥物更好的治療效果。細胞膜NVs 作為藥物遞送載體可以降低肝腎組織對藥物的清除，從而降低藥物對正常組織的不良反應［11，22-23］。由于胚胎腎細胞分化程度較低，基本不表達胞外配體所對應的受體分子，因而具有較低的免疫原性，因此本研究采用人胚腎HEK293 細胞的細胞膜作為原材料制備NVs，利用其擔載并遞送DOX 用于抗黑色素瘤細胞的研究。本研究結果表明：NVs 與NIH3T3 細胞具有良好的生物相容性；短時間（3 h）內(nèi)納米藥物NVs-DOX 內(nèi)吞效率略低于小分子DOX，與其通過自由擴散的方式快速入胞有關，納米藥物主要以內(nèi)吞方式進入胞內(nèi)，速度較自由擴散稍慢；但48 h 處理結果顯示：納米藥物NVs-DOX 具有與小分子DOX 相當?shù)哪[瘤細胞毒性，提示納米藥物NVs-DOX 具有高效殺傷黑色素瘤B16F10 細胞的特性。

綜上所述，本研究成功制備了基于細胞膜NVs的納米藥物NVs-DOX，細胞膜NVs 在成纖維細胞上顯示出良好的生物相容性，納米藥物NVs-DOX可被黑色素瘤B16F10 細胞高效內(nèi)吞并展示出與小分子DOX 相當?shù)哪[瘤細胞殺傷效應。本研究為開發(fā)高效低毒的新型抗癌藥提供了新思路。